数字化可视昆虫之虫体连续石蜡切片制备技术研究

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本文针对昆虫组织结构的特点,以粘虫幼虫为试验材料,从生物组织制片技术的全过程出发,对每一步骤的操作,都从试剂的选择、最佳的用量、合理的处理时间、最适宜的温度和最优的处理方法等方面进行了细致研究,并且在这些研究的基础上,制成整个虫体的连续石蜡切片,又借助显微数码照相机实现整个幼虫内部解剖结构的数字化。具体研究结果如下:第一,利用天然饲料——玉米幼苗,对粘虫进行散养,在连续饲养的3代中,卵的孵化率都在90%以上,老熟幼虫化蛹率的平均值为87.5%,蛹的羽化率最高为98.0%,每头雌蛾一生累计产卵量的平均值都在1200粒左右。通过对虫体形态学指标的测量(幼虫头壳宽度等)和其它幼虫生物学特性的观察,很好的区分了不同龄期的幼虫,为后续试验提供了丰富且龄期整齐的虫源。第二,从生物组织制片中常用的混合固定液里选出Bouin氏、Bragil氏和Carnoy氏等18种固定液,通过20℃下对每种固定液的固定时间、是否导致虫体形变、是否导致虫体硬化及预切片效果等方面的对比,发现Bouin氏、Bragil氏和Carl氏等9种混合固定液对粘虫幼虫的固定效果较优。对这9种混合固定液的固定效果,在温度改变和用量倍数不同时的情况进行比较,发现:随环境温度的升高,固定速率加快,但与此同时虫体形变量也加大;温度改变相同幅度时,穿透速率较慢的固定液的固定速率提高较快;综合比较,35℃是固定耗时相对较短、形变量相对较小、均匀程度相对较高的理想温度。绝大多数固定液,在20℃下用量倍数应为虫体的30倍,对于穿透力较强的固定液可以减少到10倍。幼虫龄期和蜕皮后时间长短对这9种较优固定液的固定效果有影响。幼虫龄期越高,虫体越大,固定用时越长。4龄和5龄的幼虫之间固定时间相差较小,且形变情况和均匀程度完全一致。但基于后期制片操作和显微观察时对虫体大小的要求,5龄幼虫更加适合。蜕皮后时间越久,固定所需时间越长,其中“10min以内”和“10-20min”两个时段内的幼虫固定用时间相等且耗时最少,所以幼虫蜕皮后20min之内为其固定最佳时段。第三,以水作溶剂的固定液要用流水冲洗,以乙醇作溶剂的固定液要用一定浓度的醇洗涤;以酒精、甲醛、冰醋酸、和氯仿为主要固定试剂的固定液很容易清洗干净,只需更换2-3次洗涤液即可;而含苦味酸和升汞两种成分的固定液较难清洗,洗涤耗时都在10h左右;重铬酸钾和铬酸两种试剂最难清洗,都须用流水冲洗24h;以水、低浓度酒精(50%或60%)或95%的酒精作为洗涤剂的试虫,洗涤时间应严格掌握,不可过长,否则会引起虫体的形变。第四,对用不同固定液固定的虫体的染色结果显示,染色液的效果受到固定液的一定影响,其中Ehrlich氏酸性苏木精,Mayer氏苏木精和复制曙红对9种固定液固定的虫体的着色均较好。用不同浓度进行整体染色时,Mayer氏苏木精染液2倍稀释液和Ehrlich氏酸性苏木精染液10倍稀释液的效果最佳,着色均匀适度无过染,虫体自然无形变。40℃时,Ehrlich氏酸性苏木精染液对虫体染色至少5d,Mayer氏苏木精染液染色需3d,而复制曙红染液只需2d。3种染色液的染色时间都随温度的升高而缩短,同时虫体的形变量也开始出现和加剧,40℃是染色速度较快而形变量较小的最优值。第五,在不同室温和切片厚度条件下,所需石蜡熔点不同:环境温度越高,切片厚度越薄,切出完整片子所需的石蜡的熔点越高;反之,需用软蜡。第六,通过对两种粘片剂贴片效果的比较,发现明胶甘油比Mayer蛋白甘油更好。对3种透明剂脱蜡耗时的研究表明,透明剂的不同和组织结构的差异都会对脱蜡时间产生影响,二甲苯最快,只需10min,苯居中,耗时约30min,叔丁醇最慢,要35min。对比3种封藏剂的封片效果发现,纯甘油的效果最差,不但易使组织脱色,折光率也较虫体组织低,封后的切片标本在镜下模糊不清。甘油明胶封片效果相对较好,组织结构可以辨识,但也造成少量脱色。加拿大树胶封片效果最佳,不仅不产生退色现象,透光率也较适宜,封片后组织的颜色与未封片前镜检效果接近。
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