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胸腺五肽（thymopentin,TP5）是位于胸腺生成素Ⅱ的第32～36位氨基酸残基片段,具有与TPⅡ相似的生物学活性,能双向调节失衡的免疫系统。TP5能诱导T细胞的分化,促进T淋巴细胞亚群发育并活化,是一种重要的免疫调节剂,临床上主要用于免疫缺陷症和自身免疫性疾病的治疗。因TP5半衰期较短（30 s）,人们制备了许多TP5的类似物或模拟肽来延长TP5的半衰期并提高其活性,如在TP5之间插入稳定性成分、用D-型氨基酸取代L-型氨基酸,或者制成环肽等,尽管这些工作取得了一定的成绩,但结果却难以令人满意。Tα1是一种天然存在于多种生物组织的多肽物质,由28个氨基酸残基组成,等电点4.2,分子量3108 Da。Tα1具有与TP5类似的免疫活性,主要是增强细胞免疫,用于免疫缺陷或免疫功能低下相关的疾病。Tα1的血浆半衰期约1.5 h。目前,Tα1主要从动物组织中提取或化学合成,但从组织中提取存在产量低、产物不稳定等缺点,而化学合成则价格昂贵。为了提高TP5的活性,延长其半衰期,本研究依据肽链延长可提高多肽类药物体内半衰期的事实,将具有相似生物活性与临床用途的TP5和Tα1借助基因工程方法连接在了一起,表达制备了Tα1-TP5融合肽。1 Tα1-TP5融合肽的基因克隆及在毕赤酵母中的表达本研究根据Tα1-TP5的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏爱的密码子,人工设计合成了Tα1-TP5全基因序列;借助Primer软件,设计了上下游引物,通过PCR反应、酶切、连接等步骤,构建了融合基因Tα1-TP5表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5。由于在毕赤酵母中表达融合肽可能出现N-端和C-端不均一的现象,在构建表达载体时时采取了两种方法:第一,将目的基因直接插在α-信号肽后面的Glu-Ala-Glu-Ala处;第二,在目的基因C-端增加了凝血酶酶切位点的编码基因,保留了6×His纯化标签。这样,既能简便快捷的用金属鳌合亲和填料纯化表达产物,又能通过凝血酶高效完全地切除N-端多余氨基酸残基和6×His标签,得到Tα1-TP5融合肽,从而提高Tα1-TP5融合肽的纯化效率。采用电激法用BlnⅠ线性化载体pGAPZαA-Tα1-TP5转化P.pastoris GS115,筛选Zeocine高抗性的阳性克隆,用煮-冻-煮法提取酵母基因组DNA,用PCR方法对P.pastoris GS115的基因表型进行了鉴定。重组转化子经摇瓶培养,Tricine-SDS-PAGE证明上清液中含有Tα1-TP5融合肽,其中两个转化子表达量较高。考查了发酵时间、培养温度对Tα1-TP5融合肽表达量的影响。结果显示,在30℃、72 h后发酵上清中的Tα1-TP5表达量最高,达32.2 mg/L。2 Tα1-TP5融合肽的分离纯化研究了Tα1-TP5融合肽的分离纯化工艺。发酵混合物经高速离心取上清,用超滤法去除大分子的蛋白酶、金属螯和层析纯化融合肽、冷冻干燥浓缩、SephadexG-25凝胶过滤脱盐、凝血酶酶切后用SephadexG-70凝胶过滤分离,再干燥浓缩,目的产物Tα1-TP5融合肽在Tricine-SDS-PAGE上呈现单一条带。ESI-MS也证实了Tα1-TP5融合肽在毕赤酵母中得到正确的分泌表达。3 Tα1-TP5融合肽的二级结构研究利用圆二色谱（Circular Dichroism,CD）与傅立叶变换红外光谱（fouriertransform infrared spectroscopy,FTIR）对Tα1-TP5融合肽的二级结构进行了分析。CD结果显示Tα1-TP5融合肽中二级结构的各构象分别是α-helix为32.01%,β-antiparallel为8.50%,β-parallel为8.86%,β-turn为17.02%,random coil为33.61%,说明Tα1-TP5融合肽分子结构中,α-helix和random coil是二级结构的主要部分。该结果FTIR的分析结果基本一致,二种分析方法相互补充,相互印证。4 Tα1-TP5融合肽体外半衰期的研究从家兔心脏取血后进行肝素抗凝,加入一定浓度的多肽药物,37℃水浴,于不同的时间点取样,用盐酸丙酮（盐酸:丙酮:水=1:40:5,v/v）对血浆样品进行处理,高速离心得到沉淀,用醋酸溶解。用RP-HPLC测定不同保温时间血浆中Tα1-TP5、Tα1及TP5的浓度,计算Tα1-TP5、Tα1及TP5体外血浆半衰期。结果表明,Tα1-TP5、Tα1及TP5的血浆半衰期分别为140±14 min、127±11 min和5.6±0.7 min。Tα1-TP5融合肽较TP5的体外血浆半衰期有明显差异（p＜0.01）。5 Tα1-TP5融合肽的活性研究小鼠脾细胞增殖实验表明,在系列浓度为10-11～10-6mol/L时,Tα1-TP5融合肽对昆明小鼠脾淋巴细胞的的最大增殖率为50.97±5.19%,Tα1的最大增殖率为45.38±8.26%,TP5融合肽的最大增殖率为40.61±5.17%,Tα1-TP5融合肽与TP5之间有显著性差异（p＜0.01）。在巨噬细胞的吞噬实验中,Tα1-TP5融合肽组、Tα1组、TP5组和对照组的廓清指数K分别为0.020±0.0010、0.016±0.0007、0.013±0.0008和0.005±0.0006,而对应的吞噬指数依次为3.95±0.19、3.73±0.56、3.43±0.29和2.48±0.40。结果表明,各药物组均能影响正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能,且融合肽的廓清指数K和吞噬指数α也显著高于其它组（P＜0.01）。通过研究Tα1-TP5、Tα1和TP5对小鼠血清中IL-2的表达的影响表明,Tα1-TP5融合肽组的平均水平为848.81±46.70 pg/mL,Tα1组的平均水平为761.50±31.33 pg╱mL,而TP5组的平均水平为749.62±29.08 pg/mL,对照组为718.35±32.16 pg/mL,融合肽较其它实验组有显著性差异（P＜0.01）。这表明Tα1-TP5融合肽较Tα1和TP5能更有效地促进淋巴细胞分泌IL-2。考虑到Tα1-TP5融合肽的结构与功能的关系,认为Tα1-TP5融合肽免疫活性的提高是由于Tα1-TP5构象的微小变化,尤其是α-helix含量的升高引起的。因为α-helix被认为是Tα1的主要活性中心,α-helix含量的升高,不仅显著延长了Tα1-TP5融合肽的半衰期,而且Tα1-TP5融合肽与靶细胞的持久作用更有利于免疫活性的增强。本实验结果表明,Tα1-TP5融合肽具有潜在的临床应用价值。本研究取得的主要成果有:（1）构建了pGAPZαA-Tα1-TP5表达载体,并采用毕赤酵母表达系统对Tα1-TP5融合肽进行了分泌表达,表达量可达32.2 mg/L,用ESI-MS证实了其结构的正确性。（2）建立了实验室水平的Tα1-TP5融合肽分离纯化工艺,经过超滤、亲和层析和凝胶过滤三步骤,所获得产品的纯度可达到99%以上。（3）用CD和FTIR研究了Tα1-TP5融合肽的二级结构,表明α-helix和random coil是其二级结构的主要组成部分。推测Tα1-TP5融合肽二级结构中的α-helix构象是影响其活性的重要因素。（4）与TP5和Tα1相比较进行了Tα1-TP5融合肽体外血浆t1╱2研究,显示Tα1-TP5融合肽的半衰期约为140±14 min,高于同比试验TP5（5.6±0.7 min）和Tα1（127±11min）。（5）进行了胸腺Tα1-TP5融合肽体内外免疫活性研究,表明融合肽Tα1-TP5在促进昆明小鼠脾细胞的增殖、增加巨噬细胞的吞噬功能,和促进IL-2表达的实验中均显示了比TP5和Tα1更高的活性,是一个活性较好的潜在的免疫调节药物。本研究为一种新型免疫调节剂的开发奠定了基础。