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微滴式数字PCR(ddPCR)作为第三代PCR技术,具有灵敏度更高、不受基质抑制的技术优势,应用于食品致病微生物的检测中有望使其检测水平得到提升。GⅡ型诺如病毒是人类急性胃肠炎的主要致病微生物,可通过食用被其污染的食品传播而感染。本研究将反转录微滴式数字PCR(RT-ddPCR)应用于GⅡ型诺如病毒的检测,可望预防和规避风险。(1)通过优化退火温度建立了检测GⅡ型诺如病毒的RT-ddPCR法,比较了此法与反转录实时荧光PCR(RT-qPCR)法的灵敏度和重复性,结果表明55.7℃为较优的退火温度,此时RT-ddPCR法的灵敏度为5.40copies/μL,高于RT-qPCR,重复性良好。(2)对病毒富集的洗脱沉淀法进行了优化,确定了较优的条件:洗脱液为牛肉膏-甘氨酸洗脱液、沉淀剂为PEG6000+PEG8000、沉淀剂作用温度为4℃,沉淀剂作用时间为4h,此时病毒平均回收率可达53.43%。(3)将优化后的富集方法和RT-ddPCR法结合应用于西生菜中GⅡ型诺如病毒的检测,比较了RT-ddPCR法和RT-qPCR法的检测限,结果表明RT-ddPCR法和RT-qPCR法检测西生菜中GⅡ型诺如病毒的检测限分别为7.86×10~2copies/g、1.44×10~4copies/g,因此RT-ddPCR法比RT-qPCR法灵敏度更高。副溶血性弧菌是引起人类急性胃肠炎的重要致病菌,主要存在于近海地区和海产品中。本研究将叠氮溴化丙錠(PMA)活菌染料技术与微滴式数字PCR技术相结合,将PMA-ddPCR法应用于副溶血性弧菌活菌的检测。(1)设计了4组引物,比较了不同引物的特异性和灵敏度,选取了tlh-2组为本研究所用引物;比较了Chelx-100法、试剂盒法和沸水浴法三种DNA提取方法的效果,选取了Chelex-100法为DNA提取方法。(2)PMA浓度和曝光时间的优化。选取6×10~2~6×10~5CFU/mL浓度的死菌液分别进行PMA浓度实验,以选择抑制死菌DNA扩增的最小PMA浓度;选取6×10~2CFU/m L浓度的活菌液进行PMA浓度实验,以选择不抑制活菌DNA扩增的最大PMA浓度;综合比较后确定16μg/m L作为PMA工作浓度。曝光时间优化实验结果为8min,此时能够完全抑制死菌扩增而对活菌扩增无影响。(3)使用PMA-ddPCR法和PMA-qPCR法检测不同活菌比例的菌液,结果表明PMA-qPCR法和PMA-ddPCR法在活菌比例大于1%时可对活菌进行检测,而在活菌比例大于10%时其检测结果有较高的准确度。(4)对建立的PMA-ddPCR法的灵敏度进行了评价,并将其与PMA-qPCR法进行了比较,结果表明PMA-ddPCR和PMA-qPCR的灵敏度均为2×10~1CFU/mL。PMA-ddPCR与PMA-qPCR相比,在灵敏度上面并未显出优势,分析原因可能为Chelex-100法无法将2CFU/m L的菌液中的DNA提取出来。(5)将PMA-ddPCR法应用于人工污染基围虾和小帆立贝这两种海产品的检测,并与PMA-qPCR法检测结果进行了比较,结果表明人工污染样品为基围虾时,PMA-ddPCR法和PMA-qPCR法的检测限分别为1.12×10~1CFU/g、1.12×10~2CFU/g;人工污染样品为小帆立贝时,PMA-ddPCR和PMA-qPCR的检测限分别为8.96CFU/g、8.96×10~1CFU/g;因此,PMA-ddPCR在低污染量样品测定中更有优势。本研究通过将微滴式数字PCR技术应用于GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌的检测,建立了满足食品快速通关及安全监测的微滴式数字PCR新型检验方法,为开发食品监控体系中低含量活致病微生物的分子生物学高通量、快速检测提供依据。