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TALENs技术是最近几年来迅速发展起来的基因靶向修饰技术,该技术能够简单、高效的在目标靶基因位点处产生多种突变效应,现已被广泛应用于各种动植物细胞及个体的基因修饰研究中。与经典的基因打靶技术相比,TALEN核酸酶在与基因打靶载体的共同作用下,具有“一步法”完成目标基因的敲除和外源基因定点敲入的优势。本研究通过利用TALENs基因编辑技术和hLF基因打靶载体在山羊BLG基因第一外显子起始密码子附近敲除目标靶序列,并在敲除位点引入人乳铁蛋白基因,从而降低山羊乳汁中对人具有致敏作用的p-乳球蛋白的含量,提高羊奶的营养和消费价值。本研究的目的是应用TALENs技术与山羊β-乳球蛋白调控序列,PCR扩增获得的hLF cDNA基因序列,人巨细胞病毒启动／增强子(Pcmv)和SV40 poly A以及HSV-TK的负筛选基因等元件,构建含新霉素抗性筛选基因(Neo)的乳腺特异性表达hLF的基因打靶载体。用构建获得的TALENs和乳腺特异性打靶载体转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选获得转基因单克隆细胞株,并通过体细胞核移植技术制备在BLG基因上定点敲入hLF的转基因山羊。移植受体并通过怀孕出生的转基因山羊,用来培育新一代高产优质不含对人致敏的,并富含对人体有益的人乳铁蛋白转基因乳用奶山羊新品系。山羊p-乳球蛋白基因(BLG)位于11号染色体,全长8088bp,编码BLG的转录单元长4698bp,5’端非翻译区2148bp,3’端非翻译区1242bp,含有七个外显子,六个内含子。本研究设计实验,按照已有报道的TALENs设计原则,以山羊BLG基因序列为模板设计TALENs,在第一外显子ATG-2189起始密码子附近选取2条靶序列,作为指导构建TALENs表达载体的靶向识别序列。选取与靶序列相对应的识别双残基模块和骨架载体,经过连接、转化、筛选、鉴定,最终获得2对TALEN表达载体(TALEN-L12/TALEN-R12、 TALEN-L 18/TALEN-R18), TALENs表达载体的构建为TALENs活性鉴定及BLG基因定点修饰的研究奠定基础。为了获得能够在山羊乳腺中特异性高效表达人乳铁蛋白的载体,本研究以山羊BLG基因为模板,PCR分别扩增出山羊5’调控序列1035 bp和3’调控序列1826bp,再以本实验室保存的BLC14为基础,载体包括5’调控序列、CMV启动／增强子、hLF cDNA基因序列、SV40poly A启动／增强子、Neo基因和3’调控序列,并通过PCR扩增的方法获得其功能基因序列,然后连接上述BLG调控序列,鉴定插入序列的正反向,挑取正确的载体。在确定正确的乳腺特异性基因表达载体之后,通过酶切线性化,再与实验室保存的含有一个HSV-TK的负筛选基因序列相连接,从而获得本实验需要的乳腺特异性表达hLF的基因打靶载体,并命名为BLTF-7-82。基因打靶载体BLTF-7-82 与 TALEN-18L/18R质粒共转染30日龄原代山羊胎儿成纤维细胞,细胞转染三天后通过药物对进行筛选。所用药物浓度为G418(800μg/mL)和GCV (10μg/mL),正负筛选维持7-14天,挑取细胞6孔板上生长状况良好的细胞克隆株,传代到24孔板中继续培养,此时药物正负筛选的浓度降低一半,最终获得药物抗性胎儿成纤维细胞125株。将筛选获得的阳性细胞进行消化,并应用特异性引物进行整合情况的检测。首先用引物cmv-1/cmv-2对人乳铁蛋白和CMV基因进行整合检测,PCR产物大小为775 bp,能扩增出目的条带的样品则为整合hLF的阳性细胞株,获得整合细胞株89株。之后将整合hLF的阳性细胞株的单克隆细胞株基因组,再分别用引物5farcmv-1/5far cmv-2和neo3 far-1/neo3 far-2对其进行定点整合检测,PCR产物大小分别为1703 bp和3604bp,同时扩增出上述两个条带,才能确定为在BLG基因上定点整合人乳铁蛋白外源基因的阳性细胞株,根据PCR检测与序列比对结果最终确定1株细胞为定点整合hLF外源基因的阳性细胞株,其基因打靶效率约为1.5×10-6。同源重组检测显示该细胞株为在山羊BLG基因座上双等位定点整合人乳铁蛋白外源基因的阳性细胞株,把该单克隆阳性细胞株命名为LDK-16进行后续的体细胞核移植。以单克隆阳性细胞株LDK-16作为供核细胞进行体细胞核移植,制作重构胚胎151枚,重构胚移植受体山羊10只,胚胎移植后30天B超检测到妊娠受体7只(妊娠率70%)。