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研究目的蛋白酶与蛋白酶抑制剂之间的活性与含量的平衡维持着人类皮肤的正常屏障功能。阿尔法-2巨球蛋白样蛋白(Alpha-2-Macroglobulin Like 1,A2ML1)乃丝氨酸蛋白酶抑制剂大家族的成员之一,其主要在表皮中高度分化的颗粒层细胞表达。至于A2ML1是如何影响表皮角质形成细胞的终末分化和皮肤屏障功能形成,目前还没有相关文献报道。本课题在研究A2ML1在基底细胞皮肤癌患者与健康正常人的皮肤组织中差异表达的基础上,继续验证到,A2ML1是通过与组织激肽释放酶7(Kallikrein Related Peptide 7,KLK7)相互作用而调控皮肤细胞的分化与黏附程度。研究方法1.用免疫组化的方法检测了正常健康人皮肤组织与基底细胞癌患者皮肤组织的石蜡包埋组织切片A2ML1的表达量与分布范围的差异。2.利用免疫共沉淀方法(Co-IP)与免疫印迹方法(western blotting,WB)检测分化前与分化后的永生化角质形成细胞(HaCaT)中内源性的A2ML1与各种丝氨酸蛋白酶(KLK7,Chymotrypsin)的相互作用。3.在人类永生化角质形成细胞(HaCaT)中,用si RNA敲低A2ML1的表达,用qPCR检测丝氨酸蛋白酶KLK5,KLK7,黏附分子桥粒糖蛋白-1(Desmocollin-1,DSC-1),桥粒芯糖蛋白-1(Desmoglein-1,DSG-1),纤维连接蛋白-1(Fibronectin-1,FN-1),钙粘附蛋白-1/2(Ecadherin-1/2,E-cad-1/2)以及分化标记内披蛋白(Involucrin,IVL),丝聚合蛋白-1(Filaggrin-1,FLG-1)的m RNA含量相对于对照组的变化;WB检测蛋白酶KLK7,黏附相关蛋白Ecad-1,FN-1,DSC-1以及分化标记蛋白IVL,FLG-1,角化粒素(Corneodesmosin,CDSN)的蛋白含量相对于对照组的变化。4.从基底细胞癌皮肤组织中挑选出A2ML1高表达与低表达的样本,与正常皮肤组织共分成三组,利用免疫组化,比较三组之间的KLK7,DSC-1,E-cad-1,FN-1,Keratin-10(KRT-10),CDSN,FLG-1的表达差异。研究结果1.A2ML1在正常皮肤组织中仅在表皮的颗粒层细胞与角质层中表达,在基底细胞癌组织中其表达量显著减少或完全缺失。2.A2ML1在未分化的HaCaT细胞中表达量很低,其表达量在分化后的HaCaT细胞中显著增加,内源性的A2ML1能与KLK7和Chymotrypsin相互结合。3.针对m RNA,敲低A2ML1对分化前、后的HaCaT中KLK7表达无影响,却会抑制分化后的HaCaT中KLK5的转录;然而KLK5以及皮肤细胞中常见的分化标记与黏附分子在HaCaT分化前是几乎不受A2ML1调控的;在分化后的HaCaT中,DSC-1,E-cad-1,Ecad-2,DSG-1,FN–1,IVL,FLG-1与对照组相比,被转染了3号和4号si-A2ML1的实验组都会呈现出相应的下调趋势。在蛋白水平上,除了只有FLG-1会在HaCaT分化后受A2ML1的调控较弱以外,HaCaT的DSC-1,FN-1,E-cad-1,CDSN,IVL在其分化前后均受A2ML1敲低带来不同程度的影响。4.通过比较健康正常皮肤、A2ML1高表达的基底细胞癌皮肤与A2ML1低表达的基底细胞癌皮肤组织免疫组化切片中的KLK7,分化标记(CDSN,FLG-1,KRT-10)以及黏附因子(DSC-1,FN-1,E-cad-1)平均光密度值,蛋白表达水平、分布区范围都有各自的显著差异。研究结论1.正常皮肤组织与基底细胞癌皮肤组织中A2ML1的表达量与分布范围有明显的差异,AM2L1在基底细胞癌中表达显著减少。2.HaCaT细胞系中的A2ML1可与KLK7,Chymotrypsin这两者丝氨酸蛋白酶发生互相作用。3.A2ML1参与到对HaCaT细胞系的终末分化蛋白与黏附分子的表达。4.健康正常皮肤和基底细胞癌皮肤组织中A2ML1的表达水平与皮肤细胞的分化和粘附程度存在关联。