背景:恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM))是皮肤肿瘤的一种,是由位于表皮基底部的黑色素细胞恶变形成的,多由痣或色素斑发展而来,一旦进入快速生长期,则预后差、死亡率高。恶性黑色素瘤的发病率在近几十年中增长迅速,每年的年增长率高达3-5%。白种人发病率高于其他肤色人种,中国和日本等亚洲国家发病率低,但是增长迅猛。恶性黑色素瘤的恶性程度高,早期易发生血行转移和淋巴转移,预后差,晚期转移性黑色素瘤的中位生存期仅为7.5个月,2年生存率为15%,5年生存率仅为5%,目前晚期性黑色素瘤的治疗是以内科治疗为主的综合治疗,单纯的放化疗疗效有限,化疗容易产生耐药,黑色素瘤细胞对射线不敏感。免疫治疗因特异性、针对性和有效性强,患者耐受性好,且黑色素瘤细胞的免疫原性好,在一定的条件下,可激活机体的特异性抗肿瘤免疫效应T细胞,易于免疫治疗的施行。恶性黑色素瘤的免疫治疗作为最有前景的一种治疗方法,虽取得了一定的进展,但总体的获益率不高。免疫治疗大多在治疗的早期显示出明显的疗效,但随着时间推移和病情进展,免疫治疗逐渐失效。研究表明黑色素瘤细胞可通过多种机制来逃避机体的免疫监视和免疫杀伤。首先,肿瘤细胞可通过自分泌或者旁分泌的方式分泌一些免疫抑制因子:转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),白介素 10(interleukin-1 0,IL-10),前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)等。这些免疫抑制因子使肿瘤局部形成一个深度免疫抑制区,不仅使身在其中的免疫细胞功能受到严重抑制,甚至功能正常、活化的免疫细胞,一旦进入此环境也将成为免疫功能抑制的“沉默”细胞。肿瘤细胞还可直接诱导机体产生免疫抑制细胞,如抑制性T细胞(suppressor T cell,TS)和调节性 T 细胞(Regulatory T cell,Tregs),或促进骨髓来源的抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)在外周进一步活化,直接抑制机体的免疫功能。Notch信号通路对细胞生长发育具有广泛而多重的影响,涉及维持干细胞状态及决定细胞的分化、增殖、凋亡和血管生成,其最主要的作用就是调节细胞分化和组织发生。Notch家族成员与肿瘤的发生发展密切相关,人类许多实体瘤及血液系统肿瘤均发现Notch受体的异常表达。Notch信号通路在肿瘤发生、发展中的重要作用包括:维护未分化状态;参与细胞命运的决定;诱导终末分化;调节肿瘤血管新生。在某些组织中Notch家族单个或多个成员具有促癌基因的作用,其过度活化可促进肿瘤的发生发展,Notch基因作为促癌基因,已发现在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌等肿瘤中表达上调;Notch基因也可扮演抑癌基因的角色,在皮肤癌、食管癌、肝癌、前列腺癌、小细胞肺癌中表达下调。此外,Notch通路可以调节多种免疫细胞的分化、发育和功能,对固有免疫和适应性免疫细胞具有非常重要的调节作用。Notch通路可以直接影响造血干细胞在胚胎发育过程中的发生,可作用于TLR/NF-κ B信号通路共同调节巨噬细胞的生物学功能,对树突状细胞的发育和分化也有一定的调节作用。Notch信号通路可以诱导肥大细胞表面的MHC-Ⅱ和OX40L的表达,从而调节肥大细胞介导的肠道黏膜免疫。对于T细胞和B细胞的发育及其功能的发挥,Notch通路也有重要的调节作用。Notch通路还参与到病毒感染、炎症反应、超敏反应及自身免疫类疾病等免疫相关疾病的发生。小分子RNA干扰技术(small interfering RNA,siRNA)是近年来基因表达调控的研究热点之一,它是将与目的基因mRNA序列互补的小分子双链RNA导入靶细胞,使靶细胞中目的基因的mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,从而特异性地阻断体内某特定基因的表达。与传统的肿瘤抑制治疗技术相比,siRNA不仅简单有效,而且能特异地下调细胞中基因的表达。此外,siRNA瘤内注射已经广泛应用于多种实体肿瘤的治疗,并起到了满意的疗效。目前,siRNA靶向抑制Notchl基因抑制肿瘤细胞生长的作用已在胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性T淋巴细胞白血病、肾癌等疾病的研究中得到了证实。Notch信号通路在免疫系统及免疫细胞中的作用已得到证实,但Notchl受体在黑色素瘤细胞中高表达,其在肿瘤微环境中的作用及在黑色素瘤细胞介导的免疫抑制中的所发挥的作用,尚不明确。本研究首先用siNotchl转染小鼠黑色素瘤细胞株,观察转染前后其分泌免疫抑制因子TGF-β、IL-10和VEGF的变化,并将转染后的肿瘤细胞与T淋巴细胞共培养,CCK8法(Cell Counting Kit 8,CCK8)检测其对淋巴细胞增殖的影响。然后用B16F1小鼠黑色素瘤细胞皮下注射制作小鼠黑色素瘤移植瘤模型,后使用靶向Notchl的siRNA对荷瘤小鼠进行瘤内注射,运用免疫组化、流式细胞术、ELISA等方法评价治疗后小鼠机体的抗肿瘤免疫功能。探讨RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因对黑色瘤细胞介导的免疫逃逸的作用及对小鼠机体抗肿瘤免疫功能的影响。目的:1.通过RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因表达,观察其免疫抑制细胞因子TGF-β、IL-10、VEGF分泌的变化及对淋巴细胞增殖的影响。2.通过对荷瘤小鼠进行Notch1 siRNA瘤内注射,并用流式细胞术、ELISA及免疫组化等方法检测相应的免疫指标,观察其对小鼠机体抗肿瘤免疫的影响。材料与方法:1.主要的实验材料1.1细胞及实验动物来源小鼠皮肤恶性黑色素瘤细胞株B16F1购自武汉大学保藏中心;C57BL/6小鼠,24只,雌性,6～8周龄,重量18～22 g,购自南方医科大学实验动物中心,合格证明编号:44002100003459,于南方医科大学南方医院实验动物中心SPF级环境中饲养。1.2实验试剂胎牛血清、高糖DMEM培养基、胰酶、Ficoll小鼠淋巴细胞分离液、刀豆蛋白 A、CCK-8 试剂盒、Notchl siRNAOligo 及阴性对照、LipofectamineTM2000、PrimeScript(?)RT reagent 试剂盒、Notch1 引物、Trizol、SYBR(?)Premix Ex Taq.TM试剂盒、山羊抗小鼠的Notchl多克隆抗体、兔抗小鼠的heyl多克隆抗体、兔抗小鼠的CD11b单克隆抗体、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、DMSO、PVDF膜、结晶紫染料、辣根过氧化酶HRP标记山羊二抗试剂盒、辣根过氧化酶HRP标记兔二抗试剂盒、DAB显色剂、AEC显色剂、伊红、苏木素、95%酒精、浓盐酸、无水乙醇、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127流式抗体及同型对照抗体等。TGF-β 1、IL-10、VEGF-A 和 IFN-γ ELISA 试剂盒。1.3实验仪器超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、恒温循环水浴锅、荧光显微镜、倒置显微镜、台式离心机、电泳系统、高速冷冻离心机、酶标仪、逆转录PCR反应仪、荧光定量流式细胞仪、分光光度计、石蜡包埋机、石蜡切片机、-80℃冰箱、微波炉、通风柜、电子秤、细胞筛网、游标卡尺、眼科镊、眼科剪、1ml注射器、培养皿、微量移液器、吸管、试管、EP管、盖玻片、载玻片、冻存管等。2.实验流程2.1靶向Notchl基因的siRNA转染小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞株应用siRNA设计软件设计靶向Notch1的siRNA,委托由上海吉玛生物公司合成。用Invitrogen公司的lipofectamine.TM2000介导的脂质体转染技术转染细胞,从预先设计的6对序列中选出1对沉默效率最高的作为目的siRNA。转染了靶向Notchl基因siRNA的B16F1细胞为实验组用siNotchl表示、转染空载体siRNA的B16F1细胞为阴性对照用siNC表示、只加转染试剂lipofectamine TMn2000的B16F1细胞为空白对照用mock表示。转染后采用RT-PCR法检测Notchl mRNA的表达,用western blot法检测Notchl蛋白及其下游hey1蛋白的表达。2.2分别运用RT-PCR和ELISA检测转染后各组免疫抑制因子含量变化。经上述siRNA技术瞬时转染小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞株,运用PCR法检测转染后各组免疫抑制因子TGF-β、VEGF、IL-10 mRNA的表达情况,随后用ELISA法检测转染后各组细胞培养上清中免疫抑制因子TGF-β、VEGF、IL-10的含量,体外初步了解RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因表达对其分泌免疫抑制因子的影响。2.3 CCK8试验检测转染后各组黑色素瘤细胞对脾T淋巴细胞增殖的影响。无菌手术取小鼠脾脏,剪碎、研磨,过细胞筛网制成单细胞悬液,用密度梯度离心法,分离脾淋巴细胞,进一步用磁珠分选的方法分离CD3+T细胞。将转染后的各组肿瘤细胞与T细胞共培养,CCK8法检测其对T淋巴细胞增殖的抑制作用。初步评价Notchl siRNA转染后的B16F1细胞对淋巴细胞增殖抑制率的影响。2.4小鼠黑色素瘤模型制作及siRNA瘤内注射。B16F1细胞皮下注射制作小鼠黑色素瘤模型,待肿瘤体积达90～11～11 0mm3后,将小鼠随机分为siNotch1组、siNC组及mock组,每组8只,分别进行siNotch1、siNC及PBS(25 μ 1/只)瘤内注射,每周2次,共7次,测量并记录各组小鼠肿瘤体积。运用免疫组化法分析各组小鼠肿瘤组织中Notch1蛋白的阳性细胞率,运用western blot法检测肿瘤组织中heyl蛋白的相对表达量。明确siNotch1瘤内注射对黑色素瘤组织中Notch通路及其下游蛋白的抑制作用。2.5运用ELISA法、免疫组化和流式细胞术评估机体的抗肿瘤免疫功能。运用ELISA法检测肿瘤组织中免疫效应因子IFN-γ及免疫抑制因子TGF-自的分泌量。运用流式细胞术检测肿瘤组织中的免疫效应细胞CD8+CTL细胞以及免疫抑制细胞Treg细胞的比例,免疫组化法分析肿瘤组织中CD1 1b+MDSCs的比例,从而深入探讨RNAi 干扰黑色素瘤细胞中Notch1基因表达对小鼠机体抗肿瘤免疫的影响。3.数据分析采用SPSS13.0软件进行统计学处理。定量数据结果用x±s表示,RT-PCR结果、western blot结果、ELISA实验结果、流式结果、小鼠肿瘤体积、免疫组化数据等定量数据,采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.靶向Notch1的siRNA转染恶性黑色素瘤B16F1后,运用RT-PCR和Western blot的方法验证沉默效率。实验结果表明,siNotch1转染B16F1细胞后的Notch1 mRNA表达水平较siNC组(P<0.01)和mock组(P<0.01)显著降低,siNC组和mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1蛋白及其下游的hey1蛋白的表达情况,siNotch1组均明显小于siNC组(P<0.01)及mock组(P<0.01),而siNC组与mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2.转染后三组间TGF-β mRNA表达水平相比较,siNotch1组的TGF-βmRNA 显著低于 siNC 组(P<0.01)和 mock 组(P<0.01),siNC 组与 mock 组比较差异无统计学意义(P>0.05)。siNotch1组、siNC组和mock组IL-10 mRNA(P>0.05)和VEGF mNA(P>0.05)的表达三组间差异均无统计学意义。转染后三组细胞上清TGF-β的浓度相比较,siNotch1组细胞培养上清的TGF-β浓度显著低于siNC组(P<0.01)和mock组(P<0.01),siNC组与mock组比较差异无统计学意义(P>0.05)。siNotch组、siNC组和mock组细胞培养上清IL-10(P>0.05)和VEGF(P>0.05)的浓度三组间差异均无统计学意义。3.转染后B16F1细胞与T淋巴细胞共培养,CCK8法检测淋巴细胞增殖的情况,计算淋巴细胞增殖抑制率。siNotch1组的淋巴细胞增殖抑制率明显低于siNC组(p<0.05)和mock组(p<0.05),siNC组和mock组的淋巴细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。体外实验表明,siNotch1转染抑制黑色素瘤细胞Notch通路之后,其对淋巴细胞增殖的抑制作用明显降低。4.制作小鼠黑色素瘤模型后,用siNotch1对荷瘤小鼠进行瘤内注射,第30天处死小鼠,测量肿瘤体积,siNotch1组的肿瘤体积显著小于siNC(P<0.01)和mock组(P<0.01),而siNC和mock组的肿瘤体积相比较差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术检测示siNotch1治疗组小鼠与siNC组(P<0.05)和mock组(P<0.05)相比有更多的CD8+T细胞浸润,而siNC组和mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。siNocth1组的Treg细胞比例明显低于siNC组(P<0.05)和mock组(P<0.05),而siNC组和mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示,siNotch1组小鼠肿瘤组织中的CD1 1b+MDSCs较siNC组(P<0.05)和mock组(P<0.05)明显降低,siNC组和mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA结果显示,siNotch1组肿瘤组织中的IFN-γ含量较siNC组(P<0.05)和mock组(P<0.05)显著升高,siNC组和mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。siNotch1组肿瘤组织中的TGF-β含量较siNC组(P<0.05)和mock组(P<0.05)显著降低,siNC组和mock组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.体外实验表明RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因表达,可以降低其分泌免疫抑制因子TGF-β的含量,从而降低其对淋巴细胞的抑制作用。2.动物实验表明RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因表达,可以增加肿瘤组织中CD8+T细胞的比例,产生更多的IFN-γ,降低免疫抑制细胞Treg细胞和MDSCs细胞的比例,从而增强小鼠机体的抗肿瘤免疫功能。