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高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza,HPAI）是一种可引起多种动物急性且高度传播的烈性疾病,并且对人类健康产生严重的威胁。由于流感病毒的突变率很高,只有抗原匹配性良好的疫苗才能提供坚实有效的防控。DNA疫苗是将目标抗原基因插入到真核表达载体中构建而成,进而接种于宿主体内发挥相应抗原的免疫保护作用。DNA疫苗具有实验操作简单,节省成本和时间等优点,是目前最有希望的一种防控HPAI、快速应对病毒变异的基因工程疫苗之一。针对目前主要流行的clade 2.3.2和clade 2.3.4.4分支H5亚型高致病性禽流感病毒（HPAIV）,构建了表达A/duck/Anhui/S1246/2015（H5N1）（AH/S1246）HA蛋白的DNA质粒pCA-S1246,体外表达鉴定后,进行了有效免疫剂量以及HI抗体持续期测定试验。同时对表达A/chicken/Guizhou/4/2013（H5N1）（GZ/4）HA蛋白的DNA质粒pCA-GZ4进行了免疫剂量测定、异源攻毒保护试验以及HI抗体持续期测定等系统的免疫效力评估。实验结果表明,pCA-S1246和pCA-GZ4的有效免疫剂量均为15μg,在监测期限内,其HI抗体水平在加强免疫后均能维持在4 log2左右,pCA-GZ4还可以有效抵御4株异源病毒的致死性攻击,可以作为抵御clade 2.3.4.4分支病毒的储备疫苗。在此基础上,采用融合蛋白和双表达框的策略分别构建了同时表达GZ/4和AH/S1246 HA蛋白的两种双价重组DNA质粒pCA-FGZ4-S1246和p CA-CGZ4-S1246。体外表达鉴定结果显示,融合表达DNA质粒p CA-FGZ4-S1246可以表达通过小肽连接的融合蛋白,串联双表达DNA质粒pCA-CGZ4-S1246能够稳定表达GZ4 HA蛋白和S1246 HA蛋白。免疫效力试验发现,两种质粒混合免疫可以有效抵御GZ/4和AH/S1246的致死性攻击,p CA-FGZ4-S1246仅能对两种病毒的攻击提供部分的保护;pCA-CGZ4-S1246对GZ/4病毒的攻击可以提供完全保护,对AH/S1246病毒的攻击提供60%的保护,结果提示有必要对双表达框质粒的构建进行进一步的优化。针对监测到的H7N9亚型HPAIV,构建了表达A/chicken/Guangxi/SD098/2017（H7N9）（GX/SD098）HA蛋白的重组质粒pCA-SD098,同时通过背靠背的优化方法,利用双表达框策略构建了共表达H7N9和H5N1 HPAIV HA蛋白的双价DNA疫苗质粒p CA-GZ4-SD098。体外鉴定表明,单质粒p CA-SD098可高效表达GX/SD098的HA蛋白,双表达框重组DNA质粒pCA-GZ4-SD098可以同时高效表达GX/SD098和GZ/4的HA蛋白。对构建好的DNA质粒进行免疫效力评价,pCA-SD098能够100%抵御H7N9 HPAIV的致死性攻击,双价DNA质粒pCA-GZ4-SD098、质粒pCA-SD098和pCA-GZ4混合免疫均能同时对H7N9和H5N1 HPAIV的致死性攻击提供100%的保护,有效降低低致病性H7N9病毒感染后的载毒量。结果表明,双价质粒pCA-GZ4-SD098可以作为一种通用的DNA疫苗来同时防控目前流行的H7N9和H5N1HPAIV,但其最适免疫剂量等还需做进一步的试验。本研究针对目前主要流行的H5亚型和H7亚型HPAIV,分别构建了单独表达和共表达不同HA蛋白的几种DNA质粒,并对其免疫效力进行了评估,结果表明,背靠背双表达框重组质粒、两种单表达质粒的混合免疫均可以诱导产生对两种外源HA蛋白的有效保护,双价质粒pCA-GZ4-SD098可以同时抵御目前流行的H7N9和H5N1 HPAIV的致死性攻击,为进一步构建三价以及多价DNA疫苗打下了坚实的基础,并有望成为一种通用型的禽流感疫苗。