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膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。Ezrin被研究发现同许多恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移有关。但是ezrin同膀胱移行细胞的作用不清楚,并且未见有用RNAi技术研究ezrin同膀胱移行细胞癌关系的研究。本实验我们首次使用siRNA抑制膀胱移行细胞癌细胞株T24中ezrin基因的表达,研究ezrin在膀胱癌发生、发展、侵袭中的作用.本实验同时探讨了RhoA与ezrin在膀胱癌中的关系。为探讨膀胱癌基因治疗新途径提供理论基础。第一部分膀胱移行细胞癌组织中ezrin、CD44的表达目的探讨ezrin、CD44在膀胱移行细胞癌中的表达与意义方法1、采用免疫组织化学检测60例膀胱移行细胞癌与14例正常膀胱组织中ezrin、CD44的蛋白表达。2、采用RT-PCR方法检测40例膀胱移行细胞癌与10例正常膀胱组织中ezrin、CD44的mRNA表达.结果1、ezrin、CD44在膀胱移行细胞癌组织中的蛋白表达明显高于正常膀胱组织(P<0.05), ezrin、CD44的蛋白表达与膀胱移行细胞癌组织的病理分级、临床分期密切相关,ezrin、CD44蛋白表达的阳性表达随着膀胱肿瘤病理分级、临床分期的增高而增高(P<0.05)。2、ezrin、CD44在膀胱移行细胞癌组织中的mRNA表达明显高于正常膀胱组织(P<0.05), ezrin、CD44的mRNA表达与膀胱移行细胞癌组织的病理分级、临床分期密切相关,ezrin、CD44mRNA的阳性表达随着膀胱肿瘤病理分级、临床分期的增高而增高(P<0.05)。3、ezrin、CD44的蛋白表达在膀胱移行细胞癌中有正相关性。结论ezrin、CD44蛋白均在BTCC中表达异常增强,在BTCC发生、发展过程中起重要作用。ezrin可作为诊断、判断预后、指导治疗、随访检测的指标。ezrin基因可能成为BTCC新的治疗靶点。第二部分应用RNAi沉默ezrin基因对膀胱移行细胞癌株生物学行为的影响目的探讨ezrin基因表达与膀胱移行细胞癌株生物学行为的关系。方法1、设计siRNA ezrin,用于干扰并下调T24细胞中目的基因的表达。2、采用RT-PCR以及western-blot方法检测实施siRNA干扰后,T24细胞中ezrin的mRNA以及蛋白量。3、采用绘制细胞生长曲线、MTT实验、流式细胞检测、细胞划痕实验以及细胞迁徙实验、细胞粘附实验,观察siRNA干扰后,细胞生物学行为变化。结果1、设计的siRNA能够很好的对目的基因产生沉默效应。2、转染siRNA后的实验组T24细胞,ezrin的mRNA表达量较对照组明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。ezrin蛋白表达量显著下调,差异有统计学意义。3、转染siRNA后的实验组T24细胞,细胞生长速度较对照组明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)；实验组T24细胞凋亡率为(30.37±8.37)%,实验组细胞凋亡率同空白组、阴性对照组比较,凋亡率明显增加,(p<0.05)。24小时后,实验组T24细胞迁移到划痕区的细胞明显低于空白组和阴性对照组。实验组发生迁移细胞数目明显降低,迁移能力明显下降,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。siRNA干扰可以降低细胞的粘附能力,空白组、阴性对照组、实验组细胞粘附率分别为72.3±5.1%,70.5±5.7%以及39.2±4.6%,差异有统计学意义(p<0.05)结论siRNA可以明显下调T24细胞中ezrin的mRNA以及蛋白表达量,且导致细胞生物学行为的改变,表现为细胞的生长减慢、凋亡增加,细胞的迁移能力及粘附能力降低。第三部分ezrin同RhoA信号传导通路关系的研究目的探讨RhoA及ezrin在膀胱癌中的关系。方法1)EGF作用于膀胱移行细胞癌T24细胞,采用Western-blot检测ezrin、RhoA、磷酸化RhoA的蛋白含量变化。2)将EGF及RhoA激酶抑制剂Y-27632作用于膀胱移行细胞癌T24细胞,检测ezrin、磷酸化RhoA的蛋白含量变化。结果Western-blot结果显示,在给予EGF刺激后,p-RhoA水平逐渐升高,于10、30、60、90min时分别升高了70±11%,250±23%,420±47%以及490±43%。在EGF刺激下RhoA蛋白表达无明显变化。Western-blot结果显示,在给予EGF刺激后,ezrin水平逐渐升高,于8、16、24小时分别升高了170±60%,310±73%,750±47%。用Y-27632预处理T24细胞,EGF诱导的RhoA磷酸化水平明显受到抑制,同时ezrin蛋白表达水平也受到抑制。结论RhoA可能作为ezrin的上游调控元件。