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由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)引起的花叶病是世界大豆种植区普遍发生并广泛分布的大豆病毒病害之一。该病严重影响大豆的品质和产量,对大豆生产构成很大威胁。SMV属于马铃薯Y病毒科(Potyvridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus),寄主范围狭窄,主要局限于豆科植物。Potyvirus是世界上最大的、对经济影响最重要的植物病毒属。Potyvirus病毒编码11个蛋白,通过与其它编码蛋白及寄主蛋白的相互作用来共同完成病毒的侵染循环。其中P3蛋白变异程度最大,不仅参与病毒的复制和运动,而且与症状表现有关。实验室前期通过酵母双杂交(Y2H)的方法从大豆cDNA文库中筛选得到与大豆花叶病毒P3蛋白互作的候选寄主蛋白。本研究从中随机选取了 6个感兴趣的大豆寄主蛋白,分别命名为 GmTIM、GmHR、GmADF2、GmRTNLB2、GmeEF1A 和 GmSEC,并从大豆感病品种’南农1138-2’中分别克隆出这6个基因的编码区全长。主要研究结果如下:1、应用酵母双杂交(Y2H)方法对6个大豆蛋白与SMVP3蛋白间互作的初步验证采用膜蛋白酵母双杂交系统,将SMVP3与6个大豆蛋白(GmTIM、GmHR、GmADF2、GmRTNLB2、GmeEF1A和GmSEC)编码区全长分别构建到酵母表达载体pBT3-STE和pPR3-N,蛋白质印迹(Westemblotting)实验表明目的基因均能在酵母细胞内正确表达。酵母共转化结果表明,SMV P3可分别与6个大豆蛋白在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal培养基上生长良好,且菌落变蓝。该结果初步表明,SMVP3可与这6个大豆蛋白互作。2、6个大豆蛋白与SMVP3蛋白间互作的进一步验证及蛋白亚细胞定位分析进一步通过双分子荧光互补(BiFC)试验对以上互作进行体内验证。将SMVP3 与 6 个大豆蛋白(GmTIM、GmHR、GmADF2、GmRTNLB2、GmeEF1A 和 GmSEC)分别构建到BiFC载体pEarleyGate201-YC和pEarleyGate202-YN。融合表达载体通过农杆菌介导在本氏烟叶片内进行瞬时表达。接种农杆菌的叶片采用激光共聚焦显微镜进行荧光观察。结果表明,SMVP3与6个大豆蛋白均可以发生强烈互作,产生稳定的荧光。其中,P3与大豆GmTIM、GmHR的互作出现在本氏烟细胞的细胞膜。P3与大豆GmADF2的互作区域在细胞膜和细胞骨架。P3与大豆GmRTNLB2、GmeEF1A和GmSEC的互作区域均在细胞膜、细胞核和细胞骨架。蛋白亚细胞定位结果与BiFC结果类似,GmTIM、GmeEF1A蛋白定位在细胞膜,GmADF2蛋白定位在细胞膜及细胞骨架上,GmHR、GmRTNLB2、GmSEC及P3蛋白均定位在细胞膜和细胞核上。以上结果表明,SMVP3的确可与这6个大豆蛋白发生互作。3、SMV胁迫下6个互作大豆基因的表达动态分析采用实时荧光定量RT-PCR,对SMV胁迫下6个互作大豆基因的表达量进行了动态表达分析。结果表明大豆6个GmTIM、GmHR、GmADF2、GmRTNLB2、GmeEF 1A和GmSEC mRNA的表达水平呈现不同的变化。GmTIM mRNA在接种2 h后表达量有所增加,在处理24h表达量与对照相比达到最高,14d时又有所上调。接种初期GmHRmRNA表达水平基本不变,在12h时表达量最高。接种初期GmADF2mRNA表达水平呈上升趋势,12h时达到最高,在症状表现期14d时表达量上调。接种初期,GmRTNLB2症状表现期14d时明显上调。接种初期GmeEF1AmRNA表达水平缓慢上调,24h上调明显,表达量达到最高,之后下调。接种初期,随着接种时间的延长,GmSEC mRNA表达水平呈上调趋势,24 h时达到最高。4、6个大豆基因的生物信息学分析本研究对6个大豆基因进行了生物信息学分析,结果预测GmTIM属于跨膜蛋白,有四个跨膜区,氨基酸序列相对保守,进化树分析结果显示GmTIM与菜豆的TIM蛋白亲缘关系较近,与其他作物的TIM蛋白亲缘关系较远。GmHR属于跨膜蛋白,有三个跨膜区,氨基酸序列相对不保守,有很多有别于其他植物的基序,进化树分析显示GmHR与蒺藜状苜蓿和菜豆的HR蛋白亲缘关系最近,与拟南芥、烟草和水稻的HR蛋白亲缘关系较近,与其他作物可可和蓖麻的HR蛋白亲缘关系较远。GmADF2氨基酸序列比对结果显示GmADF2氨基酸序列相对保守,C端比N端保守,进化树分析结果显示GmADF2与鹰嘴豆的ADF2蛋白亲缘关系最近,与烟草和马铃薯的ADF2蛋白亲缘关系较近,与其他作物ADF2蛋白亲缘关系较远。GmRTNLB2属于跨膜蛋白,有四个跨膜区,氨基酸序列比对结果显示GmRTNLB2氨基酸序列变异性大,与鹰嘴豆氨基酸序列最相似,进化树分析结果显示GmRTNLB2与鹰嘴豆的RTNLB2蛋白亲缘关系最近,与木本棉的RTNLB2蛋白亲缘关系较近,与其他作物RTNLB2蛋白亲缘关系较远。GmeEF1A氨基酸序列比对结果显示GmeEF1A氨基酸序列非常保守,只有几个序列的差异,进化树分析结果显示GmeEF1A与菜豆的eEF1A蛋白亲缘关系最近,与马铃薯和烟草的eEF1A蛋白亲缘关系较近,与其他作物eEF1A蛋白亲缘关系较远。GmSEC属于跨膜蛋白,有十个跨膜区,氨基酸序列比对结果显示GmSEC的氨基酸序列很保守,GmSEC与同为豆科的蒺藜状苜蓿,鹰嘴豆具有一些特有的氨基酸基序,进化树分析结果显示GmSEC与蒺藜状苜蓿和鹰嘴豆的SEC蛋白亲缘关系最近,与拟南芥、烟草和番茄的SEC蛋白亲缘关系较近,与其他作物的SEC蛋白亲缘关系较远。上述结果表明,SMV P3可与6个大豆蛋白(GmTIM、GmHR、GmADF2、GmRTNLB2、GmeEF1A和GmSEC)直接互作,本研究对6个寄主蛋白在SMV侵染中的具体作用进行了讨论。