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背景与目的
结肠癌是我国发病率很高的恶性肿瘤,其重要的治疗手段化疗,由于多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象,常导致化疗效果的降低,严重影响了结肠癌患者的生存期和生存质量。因此多药耐药现象成为临床迫切需要解决的问题,以往对结肠癌多药耐药的研究多集中在多药耐药相关蛋白(multidrugrelated protein,MRP)及P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)等方面。近年来发现神经酰胺糖基化水平的提高可能是肿瘤细胞多药耐药的一个新机制,而葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylcemmide synthase,GCS)是神经酰胺糖基化的关键酶。研究发现GCS可以使神经酰胺糖基化为无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide,GlcCer),减少细胞凋亡,促进肿瘤细胞多药耐药发生。
本研究首先用RT-PCR、免疫细胞化学法检测了GCS在两种结肠癌细胞系HCT-8和HCT-8/VCR中的表达情况,然后将靶向GCS的UGCG shRNA Plasmid转染入人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR,检测转染后GCS的表达水平和对多药耐药的影响,。本课题从基因、蛋白等方面研究GCS与结肠癌发生、发展以及多药耐药产生的关系,并运用RNA干扰技术下调GCS的表达观察能否逆转结肠癌多药耐药,为临床提高结肠癌化疗敏感性多药耐药的逆转和提供一定的理论方向。
方法：
1常规培养HCT-8/VCR和HCT-8两种细胞,其中HCT-8/VCR细胞培养液中加入长春新碱(vincristine,VCR)2ug/ml,以维持其相应的耐药表型。开始测定前撤药,进行无药培养2周。
2用RT-PCR在mRNA水平、用细胞免疫化学法在蛋白水平测定GCS在HCT-8和HCT-8/VCR两种细胞中的表达。
3用细胞活性(Cell Counting kit-8,CCK-8)法,测定HCT-8和HCT-8/VCR对VCR、5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)的耐药情况。
4 UGCG shRNA Plasmid转染HCT-8/VCR细胞。
5 RT-PCR在mRNA水平、western blot在蛋白水平上检测HCT-8/VCR转染UGCG shRNA Plasmid后GCS表达的情况。
6 CCK-8法检测转染UGCG shRNA Plasmid后HCT-8/VCR细胞对VCR、5-FU和DDP的敏感性。
结果：
1 RT-PCR、免疫细胞化学结果表明:GCS在HCT-8和HCT-8/VCR细胞中均有表达。RT-PCR结果显示,GCSmRNA的相对表达量HCT-8为0.25±0.02,HCT-8/VCR为0.98±0.01,耐药细胞HCT-8/VCR表达水平较高,显著高于亲本细胞HCT-8(p<0.05)；免疫细胞化学结果显示,GCS蛋白的相对表达量HCT-8为91.51±1.20,HCT-8/VCR为118.44±1.56,耐药细胞HCT-8/VCR表达水平较高,显著高于亲本细胞HCT-8(p<0.05)。
2 CCK8分析结果显示:HCT-8/VCR细胞对VCR、5-FU和DDP的IC50均高于HCT-8细胞(p<0.05)。表明HCT-8/VCR对VCR、5-FU、DDP等多种化疗药物耐药,具有多药耐药性。
3 RT-PCR和Western blot结果显示转染UGCG shRNA Plasmid后的HCT-8/VCR的GCSmRNA和蛋白的相对含量明显低于HCT-8(p<0.05)；表明靶向GCS的UGCG shRNA Plasmid成功了的降低了GCS的表达。
4 CCK8检测转染UGCG shRNA Plasmid后的HCT-8/VCR细胞结果显示,与转染前比较,转染后HCT-S/VCR细胞对ADR、VCR、5-FU和DDP的IC50减小,敏感性增高。
结论：
1结肠癌细胞HCT-8和HCT-8/VCR中均存在GCS基因的表达,但表达高低不同。HCT-8/VCR中GCSmRNA和蛋白的表达水平较高,明显高于HCT-8,提示GCS参与了结肠癌的发生、发展过程,和结肠癌细胞的MDR现象形成有密切关系。
2 UGCG shRNA Plasmid抑制了GCS的表达,使转染后的HCT-8/VCR细胞对化疗药物的敏感性增高,可以有效的逆转了肿瘤细胞的多药耐药现象。