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第一部分HPV16 E6调控EGFR信号通路对宫颈鳞癌细胞放射治疗敏感性影响的研究研究背景:宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大威胁女性健康的妇科肿瘤,也是最常见的恶性肿瘤之一。据估计,2018年新增57万例患者,占女性癌症总数的6.6%(世卫组织报告,2018年),新诊断病例中90%以上病理类型为宫颈鳞状细胞癌(Cervical squamous cell carcinoma,CSCC),约25%已为局部进展期。局部进展期宫颈癌(Locally advanced cervical cancer,LACC)患者大多是采用以放疗为主含铂类方案化疗的同步放化疗(Concurrent chemoradiotherapy,CCRT)治疗,比单独放疗提高16%的5年生存率,但仍有约50%患者在初始治疗的2年内发生局部复发及远处转移。特别是III期5年生存率大约30%左右,而IV期5年生存率下降到15%以下,因此明确放疗敏感性因素并进行适当干预以提高放疗疗效,并延长生存期对LACC的临床治疗具有非常重要意义。90%以上的宫颈癌患者有人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染,其中HPV16与鳞癌相关。HPV16 E6和E7基因为癌基因,能促进肿瘤发生和进展。宫颈癌组织中有70-90%为表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)阳性,EGFR与较差的治疗疗效及预后相关。1995年,Peto等首次报道了EGFR信号通路与HPV16癌基因表达之间的相互作用[1]。HPV16 E6是表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)诱导信号的靶点,其活性在宫颈癌细胞中被EGF扩增,确立了HPV16 E6的表达与EGFR水平相关性的基础[2]。另有研究表明,不仅E6蛋白激活EGFR信号传导通路,而且EGFR的表达水平也影响E6蛋白表达水平,最终影响宫颈癌细胞株的生长速度[3,4]。因此抗EGFR治疗或酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗宫颈癌的研究一直在进行中。HPV16感染的宫颈鳞癌对放疗敏感,其机理还不十分清楚。有研究指出HPV相关的头颈部鳞癌放疗敏感高,有不依赖p53调控凋亡的另一条途径,可能与E6蛋白调控EGFR下游信号通路的AKT有关。因此假设HPV16感染宫颈鳞癌对放疗敏感与下游信号通路的AKT磷酸化或功能失活相关,通过细胞增殖、凋亡以及动物实验来验证假设。研究目的:通过HPV E6基因转染C33A宫颈鳞癌细胞的增殖实验,确立E6是癌基因;探讨HPV16 E6过表达的C33A细胞较对照组放疗敏感,明确E6过表达组细胞放疗凋亡不依赖于p53调控凋亡的途径;通过敲低E6过表达组的E6基因,进一步说明E6基因对放疗敏感性的影响;运用放疗(Radiotherapy,RT)、EGFR抑制剂尼妥珠单抗+放疗(Radiotherapy+Nimotuzumab,RT+Ni)分别处理E6过表达及敲低组C33A细胞,明确HPV6 E6、EGFR与放疗的相关性,并同时检测EGFR下游信号通路的调控因子,探索可能的调控机制;最后构建HPV16 E6过表达和对照细胞的宫颈鳞癌裸鼠皮下荷瘤模型,以RT、RT+Ni作为处理因素,进一步探索HPV16 E6调控EGFR下游信号通路的调控因子AKT对宫颈鳞癌放疗敏感性的影响。研究方法:1、CCK-8分别检测对照细胞及RT、RT+Ni处理的HPV16 E6过表达和HPV16 E6敲低C33A细胞增殖的变化;2、流式细胞术分别检测对照及RT、RT+Ni对HPV16 E6过表达和HPV16 E6敲低C33A细胞凋亡率和周期分布的影响;3、q RT-PCR和Western blot分别检测对照及RT、RT+Ni的HPV16 E6过表达和HPV16 E6敲低C33A细胞的EGFR、AKT、ERK1/2、P53、自杀相关因子(Factor associated suicide,Fas)以及Caspase-3表达量的变化;4、建立宫颈鳞癌裸鼠皮下荷瘤模型,根据成瘤速度和肿瘤体积进一步观察对照及RT、RT+Ni对HPV16 E6过表达及对照细胞的影响,HE染色观察肿瘤组织形态,免疫组织化学技术检测凋亡相关蛋白表达水平。研究结果:1、CCK-8实验结果显示:HPV16 E6过表达C33A细胞光密度(Optical density,OD)值明显高于对照组细胞,在48h开始出现差异,差异具有统计学意义(P<0.05),RT组OD值明显低于对照组细胞并在72h开始差异具有统计学意义(P<0.05),RT+Ni组OD值明显低于对照组细胞并在48h开始差异具有统计学意义(P<0.05);另外,RT+Ni组OD值明显低于RT组细胞并于72h开始差异具有统计学意义(P<0.05)。HPV16 E6敲低C33A细胞OD值明显低于对照组细胞,并自48h开始出现差异,差异具有统计学意义(P<0.05),RT组OD值明显高于对照组细胞并在48h开始差异具有统计学意义(P<0.05),RT+Ni组中OD值明显高于对照组细胞并在48h开始差异具有统计学意义(P<0.05);另外RT+Ni组OD值明显低于RT组细胞并于48h开始差异具有统计学意义(P<0.05)。C33A细胞OD值与同组E6敲低细胞无统计学差异(P>0.05)。2、流式细胞术实验结果显示:从细胞凋亡看,HPV16 E6过表达C33A细胞RT组凋亡率明显高于对照组细胞,差异具有统计学差异(P<0.05);RT+Ni组凋亡率明显高于对照组细胞,差异有统计学差异(P<0.05);另外,RT+Ni组凋亡率明显高于RT组细胞,差异有统计学差异(P<0.05)。HPV16 E6敲低C33A细胞RT组凋亡率低于对照组细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),RT+Ni组凋亡率明显低于对照组细胞,差异具有统计学意义(P<0.05);另外,RT+Ni组凋亡率高于RT组细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。C33A细胞的凋亡率和同组的E6敲低细胞相比无统计学差异(P>0.05)。从细胞周期看,HPV16 E6过表达C33A细胞RT组G0/G1期细胞比例明显低于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);而RT+Ni组G0/G1期细胞比例低于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);另外,RT组G2/M期细胞比例明显高于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);RT+Ni组G2/M期细胞比例高于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16 E6敲低C33A细胞RT组G0/G1期细胞比例明显高于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05),RT+Ni组G0/G1期细胞比例明显高于对照细胞,差异有统计学意义(P<0.05);而在RT组G2/M期细胞比例与对照细胞相比无统计学差异(P>0.05);RT+Ni组中G2/M期细胞比例明显高于对照细胞,也高于RT组,差异有统计学意义(P<0.05)。C33A细胞的G0/G1期细胞比例与同组的敲低组细胞相比无统计学差异(P>0.05)。3、RT-PCR和Western blot结果显示:HPV E6过表达细胞EGFR、AKT、ERK1/2表达水平较对照明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);RT组AKT表达水平较对照组细胞明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);在RT+Ni组EGFR、AKT、ERK1/2表达水平较对照细胞明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)且较RT组相比进一步降低,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16 E6敲低细胞EGFR、AKT、ERK1/2表达水平较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。C33A细胞与HPV16 E6敲低细胞EGFR、AKT、ERK1/2表达水平相比无明显统计学差异(P>0.05)。Western blot检测凋亡蛋白发现,在HPV16 E6过表达细胞中,RT组Fas和Caspase 3表达水平较对照组细胞明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);RT+Ni组Fas和Caspase 3表达水平较对照组细胞明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。另外RT+Ni组Fas和Caspase 3表达水平较RT组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在HPV16 E6敲低细胞中,RT组Fas和Caspase 3表达水平较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);RT+Ni组较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)且RT+Ni组Fas和Caspase 3较RT组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。C33A细胞与各组E6敲低细胞的Fas和Caspase 3表达水平无统计学差异(P>0.05)。4、建立宫颈鳞癌裸鼠皮下荷瘤模型:发现随着肿瘤细胞种植时间的延长,肿瘤组织逐渐增大。HPV16 E6过表达肿瘤体积从第4天开始明显大于对照组肿瘤,差异有统计学意义(P<0.05);RT组从第7天开始肿瘤体积明显小于对照组肿瘤,差异有统计学意义(P<0.05);RT+Ni组从第7天开始肿瘤体积明显小于对照组肿瘤,差异有统计学意义(P<0.05)且RT+Ni组从第7天开始肿瘤体积明显低于RT组,差异有统计学意义(P<0.05)。通过免疫组化检测裸鼠荷瘤模型中肿瘤的Caspase 3和Cleaved-caspase 3与凋亡关系。镜下观察,Caspase 3和Cleaved-caspase 3主要表达于胞浆。RT组HPV E6过表达肿瘤中caspase 3和Cleaved-caspase 3表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);RT+Ni组肿瘤中caspase 3和Cleaved-caspase 3表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且RT+Ni组caspase3和Cleaved-caspase 3表达水平明显高于RT组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1、HPV16 E6蛋白表达水平与EGFR、AKT、ERK1/2表达水平正相关。2、HPV16 E6过表达的C33A细胞对放疗敏感,其对放疗诱导的凋亡机制是不依赖p53途径,可能与E6蛋白调节EGFR信号传导通路有关。3、EGFR抑制剂尼妥珠单抗加入,结合放疗,充分证实HPV16 E6阳性宫颈鳞癌放疗敏感的调控机制与EGFR下游信号通路的AKT相关,E6蛋白影响AKT磷酸化或功能失活,从而抑制EGFR-PI3K-AKT信号通路,增加放疗疗效。第二部分乙醛脱氢酶1在宫颈鳞癌组织表达与同步放化疗疗效相关性研究乙醛脱氢酶1(Aldehyde Dehydrogenase 1,ALDH1)是一种肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)标记物,其表达水平可以预测多种肿瘤的预后。本项研究运用免疫组化方法在放化疗前及放化疗中分别检测了宫颈鳞癌组织中的ALDH1表达水平,预测放化疗疗效和生存期。74例宫颈鳞癌患者放化疗前和放化疗中均取宫颈肿瘤组织行免疫组化染色测定ALDH-1表达。治疗前ALDH-1阳性39.19%(29/74);在体外照射14次,后装腔内放疗2次后再次取宫颈肿瘤组织行免疫组化染色测定ALDH-1表达48.72%(19/39),这表明放化疗未能减少或消除在宫颈肿瘤中的ALDH1阳性的肿瘤细胞。另外患者无病生存率(Disease-free Survival,DFS)与ALDH1表达无相关(11.78±1.95 vs.12.50±1.91)个月(ALDH1阳性vs.ALDH1阴性)。这项研究表明,通过放化疗难以减少宫颈鳞癌中ALDH1阳性的肿瘤细胞,ALDH1表达水平也不足以预测患者的生存。因此,在宫颈鳞癌中ALDH1表达的临床价值可能需要重新审视。