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第一部分:利用双色荧光蛋白示踪的人脑胶质瘤模型探讨肿瘤血管形成中的细胞融合问题目的:肿瘤血管生成被认为是肿瘤发生发展过程中重要的生物学现象,是决定疾病转归的重要因素。已经证实在体内外人脑胶质瘤干祖细胞参与血管形成,但具体机制未明,本实验旨在探讨人脑胶质瘤干祖细胞同宿主细胞相互融合在肿瘤血管形成中重要作用。方法:采用转基因技术建立表达红色荧光蛋白(RFP)的人脑胶质瘤干祖细胞SU3-RFP,同宿主表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠构建人脑胶质瘤原位移植模型,用组织压片、切片的方法,利用荧光显微镜和荧光扫描激光共聚焦显微镜观察宿主正常脑组织和移植瘤组织中的血管形态和组成血管的组织细胞结构。结果:在正常脑组织,压片法可见到类似于注射了血管造影剂样清晰的各级血管的形态,并根据组织部位,可大致判断血管的形态学特征;在肿瘤组织,压片法可见到红色的肿瘤血管,绿色的宿主血管,黄色的肿瘤细胞与宿主细胞共建的血管。在荧光扫描激光共聚焦显微镜下观察肿瘤组织冰冻切片,可分析血管壁的组织结构,无论是内皮细胞还是平滑肌细胞都可见由红色的肿瘤细胞、绿色的宿主细胞和黄色的肿瘤与宿主共建细胞共同组成。结论:转基因荧光蛋白示踪的可移植性胶质瘤模型,在研究胶质瘤血管形成时可清晰了解肿瘤组织中的宿主血管、肿瘤血管和肿瘤细胞与宿主细胞共建的血管。在共建血管,除了在同一根血管上可区分红色肿瘤细胞与绿色宿主细胞镶嵌排列的马赛克血管,还能见到在同一个细胞,既表达RFP又表达GFP的双阳性(融合)细胞,并且在肿瘤侵袭宿主周围组织也见到这种反应,据此表明细胞融合是肿瘤血管形成的重要途径。第二部分:骨髓间充质干细胞同胶质瘤干祖细胞体外共培养研究肿瘤血管形成中的细胞融合问题目的:获取自身表达绿色荧光蛋白(GFP)的近交裸小鼠骨髓间充质干细胞MSCs,体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs)并鉴定其生物学特性,同转染红色荧光蛋白(RFP)基因的人脑胶质瘤干祖细胞SU3-RFP体外共培养探讨两种细胞融合反应对肿瘤血管形成的驱动作用。方法:体外培养转染绿色荧光蛋白(GFP)基因的裸小鼠MSCs,利用测CCK-8生长曲线、集落形成实验、制备染色体、Rt-PCR、免疫细胞化学、流式细胞等技术观察并鉴定骨髓间充质细胞MSCs,取转染红色荧光蛋白(RFP)基因的人脑胶质瘤干祖细胞SU3-RFP与转染绿色荧光蛋白(GFP)基因的绿色裸小鼠MSCs,进行体外共培养,在荧光显微镜观察融合细胞的增殖特性,并利用CCK-8生长曲线、Rt-PCR、免疫细胞化学、流式细胞技术和转分化实验来研究融合细胞的生物学特性及形成肿瘤血管的能力。结果:MSCs在体外连续传代培养5代,高增殖活性基本不变,且表达CD105,不表达nestin、CD31,其生物学和遗传学特征稳定。随着MSCs与SU3-RFP细胞共培养时间的延长和传代次数的增加,RFP+/GFP+黄色融合细胞的比例明显增加。经流式细胞仪筛选纯化,RFP+/GFP+黄色融合细胞占83.7%±4.5%。其高增殖能力长期保持不变,且通过Rt-PCR、免疫细胞化学、流式细胞技术表明其确实为融合细胞,而非两种细胞荧光重叠,且在体外能转分化为类内皮样细胞,具备形成肿瘤血管的能力。结论:宿主骨髓间充质细胞MSCs在前5代保持稳定的生物学和遗传学特性,其与胶质瘤干祖细胞SU3-RFP能在体外培养中发生融合反应,且融合细胞驱动肿瘤血管生成。