白血病是一类骨髓造血干细胞的恶性克隆性疾病,其克隆中的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻,停止在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生累积,并浸润其他组织和器官,而正常造血功能受抑制。白血病的分类较复杂,其发病机制目前尚不完全清楚。当前采用的治疗方法主要是支持治疗、化疗及造血干细胞移植等。尽管治疗方法不断改善,但其5年生存率仍是较低,其中急性髓系白血病年轻患者和年老患者5年生存率分别为60%和10%。因此,开发新的白血病治疗方法是亟待解决的问题。近年来的报道指出,寄生虫感染和癌症之间呈现负相关。比如克鲁斯锥虫、刚地弓形虫、旋毛虫、犬弓首蛔虫、卡氏棘阿米巴及约氏疟原虫等,均在动物实验中表现出抗癌效应。疟疗,即利用疟疾感染作为治疗另一些疾病的简称。Greentree LB于1981年明确提出了疟疗用于肿瘤治疗的设想。疟疗在历史上曾成功地应用于治疗神经性梅毒。上世纪50年代德国的Werner Zabel教授曾用间日疟治疗过l9例癌症病人。我国学者陈小平等,早在上世纪80年代就将疟疾用于临床上一些肿瘤患者的治疗,也取得了一定的效果。1980年,世界卫生组织(WHO)的统计资料显示,世界各个疟疾流行区的癌症发病率都是最低的。Giugni曾报道,在疟疾流行区,癌症死亡率几乎减少一半。上世纪50年代,印度的疟疾发病率较高,而癌症很少见,到1980年,当疟疾有所控制后,癌症病人却增加了。文献曾记载有数百例恶性肿瘤患者因感染了病原生物而康复的例子,美国科学家证实至少有150例患者当时患过疟疾或伤寒。我国河南省北部地区食道癌发病率很高,而该省南部地区疟疾流行区的癌症发病率却很低。近年来,实验证明疟原虫感染对一些动物的实体瘤有一定的抗癌作用,但疟原虫感染对白血病的影响还未见报道。本研究以小鼠急性粒单核白血病细胞株WEHI-3接种BALB/c小鼠建立白血病模型,并以非致死型鼠约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XNL)感染小鼠,探讨了疟原虫感染对小鼠白血病的抑制作用及其作用机制。本论文包括《疟原虫感染对小鼠白血病抑制作用的观察》及《疟原虫感染对小鼠白血病抑制作用的机制研究》两部分。一、疟原虫感染对小鼠白血病抑制作用的观察目的:通过构建小鼠白血病模型,观察疟原虫感染对小鼠白血病的抑制作用。方法:BALB/c小鼠分为5组(每组10只),A组为正常对照组;B组为疟原虫感染组,每只小鼠腹腔接种1×10~5个含P.yoelii的红细胞(PRBC);C组为白血病组,每只小鼠腹腔接种1×10~5个小鼠急性粒单核白血病细胞(WEHI-3细胞);D组为疟原虫治疗组,即先接种WEHI-3细胞(剂量同C组),1周后再感染疟原虫(剂量同B组);E组为疟原虫预防组,即先感染疟原虫(剂量同B组),2周后再接种WEHI-3细胞(剂量同C组)。接种WEHI-3细胞后每日观察小鼠的一般情况,包括小鼠的毛色、体重变化、精神状态、活动情况等。接种WEHI-3细胞后第22天处死各组小鼠并进行骨髓涂片和肝脾组织学检查。结果:小鼠经腹腔接种WEHI-3细胞后2周开始出现消瘦,拱背,竖毛,萎靡少动,腹部膨大,行动迟缓,精神状态较差。接种WEHI-3细胞后22天,小鼠骨髓涂片显示幼稚粒单核细胞超过30%(按WHO标准骨髓中幼稚细胞≥20%即可诊断白血病),肝、脾结构破坏,大量肿瘤细胞浸润,提示造模成功。无论是在接种WEHI-3细胞前感染P.yoelii或感染P.yoelii后接种WEHI-3细胞,小鼠均呈现一定的抗肿瘤作用,具体表现为骨髓中幼稚粒单核细胞比率均显著下降(与未接种P.yoelii的白血病小鼠相比,p<0.001);肝、脾组织中肿瘤细胞浸润明显减少,特别是接种WEHI-3细胞前感染P.yoelii组小鼠,肝、脾组织结构未见明显破坏。结论:以上结果提示,疟原虫感染对小鼠白血病具有抑制作用;预先感染疟原虫可抑制小鼠白血病的发生,该研究结果为阐明疟疾流行区肿瘤发生率明显低于非流行区的现象提供了实验和理论依据。二、疟原虫感染对小鼠白血病抑制作用的机制研究目的:通过构建小鼠白血病模型,研究疟原虫感染对小鼠白血病抑制作用的机制。方法:BALB/c小鼠分为5组(每组10只),A组为正常对照组;B组为疟原虫感染组,每只小鼠腹腔接种1×10~5个含P.yoelii的红细胞(PRBC);C组为白血病组,每只小鼠腹腔接种1×10~5个WEHI-3细胞;D组为疟原虫治疗组,即先接种WEHI-3细胞(剂量同C组),1周后再感染疟原虫(剂量同B组);E组为疟原虫预防组,即先感染疟原虫(剂量同B组),2周后再接种WEHI-3细胞(剂量同C组)。所有小鼠于接种WEHI-3细胞后第22天处死,从全血中分离白细胞,用荧光标记的抗体染色,流式细胞仪检测T细胞表面标志(CD3)、B细胞表面标志(CD19)、单核细胞表面标志(CD11b)和巨噬细胞表面标志(Mac-3);用ELISA试剂盒检测血清中IFN-γ和TNF-α含量;从腹腔分离巨噬细胞,用流式细胞仪检测巨噬细胞的吞噬功能;取脾细胞、以YAC-1细胞作为靶细胞,流式细胞仪检测NK细胞杀伤活性。结果:白血病组小鼠T细胞(CD3~+)和B细胞(CD19~+)数量明显低于正常组,而单核细胞(CD11b~+)和巨噬细胞(Mac-3~+)数量明显高于正常组。小鼠无论是在接种WEHI-3细胞前感染P.yoelii或感染P.yoelii后接种WEHI-3细胞,T细胞和B细胞的水平均显著升高而单核细胞和巨噬细胞的水平明显下降,与未感染疟原虫的白血病组相比,差异有统计学意义(p<0.001),提示疟原虫感染提高了T、B细胞的增殖能力而抑制了单核细胞和巨噬细胞的增殖,与此同时,Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α的含量增加。结果还显示感染疟原虫后,白血病小鼠的巨噬细胞吞噬活性和NK细胞杀伤活性明显增强,与未感染疟原虫的白血病组相比,差异有统计学意义(p<0.001),提示固有免疫也参与了抗肿瘤效应。结论:疟原虫感染对小鼠白血病具有抑制作用,其机制为疟原虫感染提高了宿主的保护性免疫应答,包括固有免疫和适应性免疫。