目的:以香豆素-6(Cou-6)为模型药物制备甘草酸二钾修饰型纳米脂质体(纳米柔性脂质体),研究甘草酸二钾修饰型纳米脂质体促进药物细胞摄取(细胞水平)和角膜吸收(动物水平)作用及其机制,为纳米柔性脂质体这一新型纳米药物递送系统在眼科药物递送中的应用提供研究基础与理论依据。方法:1.载Cou-6纳米脂质体及纳米柔性脂质体的制备及其理化性质的研究:用薄膜分散法制备Cou-6纳米脂质体及纳米柔性脂质体,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定脂质体的包封率,用透射电镜(transmission electron microscop,TEM)观察两种纳米脂质体的形态,用激光粒度分析仪测定纳米脂质体的平均粒径、多分散性以及zeta电位,用薄膜挤压法测定两种纳米脂质体的柔变性,并对两者的理化指标进行比较。2.体内安全性评价:选用滴眼液常用防腐剂苯扎溴铵作为对照、以人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells,HCECs)为体外细胞模型,MTT法检测甘草酸二钾、纳米脂质体以及纳米柔性脂质体的细胞毒性对角膜上皮细胞增殖产生的影响。3.纳米柔性脂质体的细胞摄取机制:培养HCECs,分别加入Cou-6溶液,载Cou-6的纳米脂质体溶液及纳米柔性脂质体溶液,观察不同时间点细胞摄取量。采用抑制剂或4℃条件下预处理细胞,检测纳米脂质体与纳米柔性脂质体的细胞摄取机制,激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)分析比较两种脂质体细胞摄取机制的异同。4.动物实验检测角膜吸收:测定纳米脂质体及纳米柔性脂质体制剂点眼后不同时间点兔和小鼠的角膜以及兔房水中Cou-6的含量(HPLC法),CLSM下观察角膜内荧光,分析比较两种脂质体眼表给药后的吸收差异。5.甘草酸二钾和纳米柔性脂质体的抗炎活性:以临床上常用的非甾体抗炎类药普拉洛芬滴眼液和糖皮质激素类地塞米松滴眼液为阳性对照,以兔眼表给予花生四烯酸溶液建立眼局部炎性模型,评价甘草酸二钾和纳米柔性脂质体的抗炎活性。结果:1.纳米脂质体和纳米柔性脂质体对模型药物cou-6均具有高包封率,粒子外观观察显示两种脂质体均呈均一圆形,粒径均一,多分散系数一致,但甘草酸二钾修饰后使zeta电位升高。在透射电镜高放大倍数下(x150k)可观察到纳米柔性脂质体粒子边缘呈皱缩状,而纳米脂质体边缘平滑,提示纳米柔性脂质体脂质双分子层具有一定的柔变性。柔变性测定结果证实纳米柔性脂质体具更强的柔变性。2.hcecs的细胞毒性实验显示甘草酸二钾只有在高浓度或长时间细胞孵育时才有一定的细胞毒性,毒性具有时间和浓度依赖性,两种纳米脂质体孵育1h,均未检测到细胞毒性。3.体外hcecs的摄取实验显示:cou-6组和纳米脂质体组在细胞摄取5min即可达到饱和,且纳米脂质体组细胞摄取显著优于cou-6组,而纳米柔性脂质体则呈现出一定的时间依赖性,孵育5min到孵育60min,细胞摄取显著增加,不同时间点纳米柔性脂质体摄取水平均优于纳米脂质体组。在能量依赖性实验中,低温孵育(4℃)或叠氮化钠条件下对纳米脂质体的细胞摄取产生明显影响,预处理30min分别减少了20.47%和23.10%,而纳米柔性脂质体组无明显降低,说明纳米脂质体细胞摄取主要为依赖能量的主动转运摄取。加入不同胞吞抑制剂预处理30min后发现氯丙嗪对纳米脂质体细胞摄取的抑制效应最明显,其次是高渗蔗糖和甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,mβcd),而纳米柔性脂质体的细胞摄取受mβcd影响最明显,高渗蔗糖较纳米脂质体组抑制效应弱。clsm观察显示,纳米脂质体与hcecs共孵育后在胞质内显现为点状荧光,而纳米柔性脂质体在胞浆和细胞核中均观察到均一分散的弥散型荧光。4.两种纳米脂质体点眼后兔和小鼠房水及角膜中cou-6的浓度显示:纳米柔性脂质体组不同时间点角膜中cou-6浓度均显著高于纳米脂质体组,且角膜多次给药后的clsm照片显示,纳米柔性脂质体组相比于纳米脂质体组具有更强的角膜渗透性,但只有纳米柔性脂质体组在部分取样点房水样品中检测到cou-6。5.纳米脂质体、8.56mg/ml甘草酸二钾和相同浓度甘草酸二钾修饰的纳米柔性脂质体均未检测到抗炎活性。结论:甘草酸二钾修饰型纳米脂质体柔变性好,眼局部给药安全性高,甘草酸二钾修饰后改变了其细胞摄取机制,显著促进模型药物Cou-6的体外细胞摄取和体内角膜渗透能力,有望成为一种眼表疾病治疗的新型药物载体。