研究背景和目的骨肉瘤是来源于恶性间充质细胞,以产生骨或骨样组织细胞为特点的恶性肿瘤。骨肉瘤是青少年和儿童最常见的原发性恶性骨肿瘤,发病率为4-5/100万,其病进展快、恶性程度高且容易出现远处转移。虽然接受根治性手术和新辅助化疗的联合应用的患者五年生存率可达50%-70%,然而近30年来,骨肉瘤患者的五年生存率无显著提高且80%-90%患者明确诊断时已有全身远处转移,而已发生转移的患者五年生存率仅为20%-30%。骨肉瘤患者死亡主要原因是肺部转移和耐药发生。目前骨肉瘤发生和转移的机制尚不明确,因此探索骨肉瘤发生和转移的机制,对改善治疗效果、提高患者生存率具有重要意义和研究价值。骨髓基质抗原2(STAG2)是黏合蛋白复合体(cohesin)中四个核心亚基的其中一个,其他三个核心亚基为染色体结构蛋白1(Smc1)、染色体结构蛋白3(Smc3)、黏合蛋白复合体RAD21,cohesin主要功能与有丝分裂后期染色体分离及姐妹染色单体的形成和DNA修复有关。有文献表明,STAG2表达下调可导致cohesin功能降低或缺失,进而导致细胞染色体数目异常;形成非整倍体。细胞染色体非整倍体容易导致患癌症风险增大,故推测STAG2基因在体内可能充当一个“肿瘤抑制者”的角色,是一个抑癌基因。肿瘤免疫治疗是近年来一种重要的肿瘤治疗方法,其中细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)能有有效和特异的直接抑制、杀死肿瘤细胞,并且能避免其他治疗方法的副作用。程序性死亡受体(PD-1)是CTL表达的一种免疫抑制性受体,程序性死亡配体(PD-L1)为PD-1配体之一。当PD-L1与PD-1发生相互作用,激活CTL胞内抑制性信号,可使肿瘤抗原T细胞凋亡,引发免疫抑制效应,使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控,介导了肿瘤细胞免疫逃逸。但目前关于STAG2与骨肉瘤转移和肿瘤免疫逃逸等生物学功能的影响尚不明确。因此我们拟以骨肉瘤细胞系U2-OS为研究对象,探索STAG2缺失在骨肉瘤中的影响,并阐明其影响的信号通路及具体机制,从而为骨肉瘤的诊断和治疗提供新的分子靶标和治疗策略。实验方法及结果:一、根据公共数据库(COSMIC数据库)中的各个系统肿瘤全基因组测序,分析显示在1166例骨肉瘤中STAG2基因突变率为8.15%,并且其突变主要集中在8号外显子,导致STAG2蛋白的表达缺失。二、1.PCR基因分型结果显示:单克隆中基因组中STAG2的8号外显子双等位敲除。2.WESTERN-BLOT结果显示:在敲除8号外显子的骨肉瘤细胞中STAG2表达缺失。三、1.细胞周期结果显示:KO组的G2/M期比例高于WT组(P<0.001),GO/G1期的比例低于WT组(0.001),S期比例低于WT组(P<0.05。2.CCK8检测结果显示:在48h、72h、96h、120h检测敲除型(KO)组的细胞增殖能力比野生型(WT)组低,P值分别为P<0.001、P=0.0067、P=0.0174、P=0.0065。3.Western-Blot结果显示:STAG2缺失抑制细胞周期相关蛋白和PI3K/Akt信号通路下游关键蛋白(mTOR)的表达。四、1.Western-Blot结果显示,与细胞迁移能力相关蛋白N-Cadherin在KO组骨肉瘤细胞中灰度值明显上调,而E-Cadherin的表达明显下降。2.Transwell实验结果显示,K0组通过Transwell小室的细胞数和WT组比,明显增多(P<0.05)。五、1.CCK8 实验显示:在 0.5ug/ml、1ug/ml、1.5ug/ml、2ug/ml 顺铂(DDP)浓度时,KO组细胞活力比WT组高(P<0.001)。2.PI/AnexinV双染法流式细胞凋亡检测结果显示:在1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml顺铂DDP浓度时,K0组细胞凋亡率比WT组低(P<0.001)。六、1.实时荧光定量PCR和Western-Blot技术结果显示STAG2 KO组骨肉瘤细胞内源性PD-L1表达比WT组上调。2.免疫荧光染色流式技术显示K0组骨肉瘤细胞膜上PD-11蛋白表达上调。结论:1.STAG2在骨肉瘤中高频突变,导致表达缺失;2.体外实验表明,STAG2缺失抑制骨肉瘤细胞的增殖能力,使骨肉瘤细胞发生G2/M期阻滞,同时抑制PI3K/Akt通路和细胞周期相关蛋白表达;3.STAG2缺失导致骨肉瘤细胞易发生EMT转化,侵袭性增强;4.STAG2缺失使骨肉瘤细胞对顺铂(DDP)的耐药性增强;5.STAG2缺失使骨肉瘤细胞的内源性和膜上PD-L1表达上调,易发生免疫抑制和免疫逃逸。