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漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,广泛分布于植物,真菌和细菌中。漆酶能催化降解许多有机和无机底物,在工业应用和生物修复等方面具有广泛的用途。杂色云芝菌是一种白腐真菌,能分泌胞外漆酶。2,4—二氯苯酚(DCP)是一种毒性较强且难降解的环境内分泌干扰物,其含量检测对环境保护及人类健康具有重要意义。
本文对杂色云芝菌(Coriolus;ersicoto)漆酶的发酵生产、纯化,漆酶的催化特性以及漆酶在2,4—二氯苯酚的生物降解和光学检测方面的应用等方面进行了研究,主要结果如下:
(1)对云芝菌产漆酶的主要培养条件进行了优化,结果表明最佳产酶培养基组成为:土豆汁20%,葡萄糖20g/L,蛋白胨4.0g/L,KH2PO43.0g/L,MgSO41.5g/L,ZnSO4500mg/L,MnSO4500mg/L,CuSO4160mg/L,ABTS1.0mmol/L,Tween—800.10%。培养基初始pH=5.0,温度28℃下摇瓶培养13d。
(2)在最优条件下培养杂色云芝菌粗酶液酶活达92.2U/mL,经过超滤处理、(NH4)2SO4分级沉降、Fastflow、G-100过柱等一系列处理纯化后,获得纯度较高的漆酶。纯化后的液体样品经过冷冻干燥后制漆酶酶粉,其活力为28.4U/mg。该漆酶经SDS—PAGE检测,分子量约为64.4KD,其同功酶分子量约为35.8KD。
(3)漆酶催化2,2—连氮—双(3—乙基苯并噻)—6—磺酸(ABTS)的最适pH为2.0,最佳温度为55℃。在25℃下催化ABTS的Km值为7.78μM,Vmax为5.11x10—5M·min-1。热稳定性、储藏稳定性良好。Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+均对漆酶活性表现出一定的促进作用,而Ag+、Pb2+、Hg2+则表现为抑制,其中Mg+的促进作用相对最强,Ag+表现为抑制最强。
(4)漆酶催化氧化DCP的反应为不可逆的氧化还原反应,最佳pH值为5.0,最佳温度为45℃,在最佳催化条件下,漆酶催化氧化DCP反应的初期可视为满足一级动力学方程。
(5)以ABTS为介体,建立了漆酶.介体体系,该体系催化氧化DCP的最佳pH值为4.5,最佳温度为50℃。
(6)构建了基于漆酶—介体体系催化的DCP光学检测系统,25℃,pH=4.5时,检测范围在1x10—7—9×10—5M浓度范围之间,响应时间为40s。Mg2+、Ca2+会对检测系统造成影响,使检测结果偏大,水体中加入适量屏蔽剂可去除离子影响。该检测方法检测结果可靠。