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研究目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我国发生率较高的恶性肿瘤之一,由于其早期症状不典型,患者出现临床症状时大多已处于中晚期,且术后易复发转移,预后差,死亡率高。因此,探讨HCC发生发展的分子生物学机制,寻找起关键调控作用的分子靶点,研究特异的肿瘤诊断标志物或治疗靶分子已成为当前的研究热点。细菌鞭毛蛋白(Flagellin, FliC)是TLR5的特异性配体,研究证实,纯化的鞭毛蛋白以及表达鞭毛蛋白的细菌(沙门氏菌)对结肠癌和胰腺癌肝转移小鼠模型均显示出良好的抗肿瘤效果。恶性增生性疾病的发生、发展一般均与细胞周期调控机制紊乱有关。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)在细胞周期调控中起关键作用,因此抑制其催化活性可以对肿瘤的治疗起到积极作用。弗拉平度flavopiridol (FLA)是美国第一个进入临床试验的CDKs抑制剂,主要通过抑制CDK1、CDK2和CDK4激酶活性抑制细胞增殖。然而,临床研究数据显示,单独使用此类药物并不能达到理想的治疗效果,与现有的化疗药物的联合使用则展现出良好的治疗前景。放射性核素显像可从分子水平上实时、无创地监测疾病的发生发展,从而在疾病的早期提供功能代谢方面改变的信息。本研究选择TLR5为分子靶点,观察不同浓度的FliC与FLA对H22肝癌细胞株增殖与凋亡的影响,并以放射性核素131I作为TLR5靶向向诊断的“弹头”,连接TLR5单克隆抗体,应用131I-anti-TLR5McAb对肝癌荷瘤小鼠进行移植瘤显像和体内生物学分布研究,为肝癌的早期诊断及体内放射免疫治疗探讨新的靶向制剂。研究方法1、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化法检测TLR5的表达。2、细胞增殖毒性实验(Cell Counting Kit-8, CCK-8)检测基因重组鞭毛蛋白(rFliC, recombinant flagellin)及FLA不同给药方案对H22细胞的生长抑制作用。3、Annexin V-FITC/PI染色法流式细胞仪分析rFliC及FLA不同给药方案对H22细胞凋亡的影响。4、取对数生长期的H22细胞,皮下接种于BALB/c小鼠,建立荷瘤鼠模型。5、采用四氯二苯基苷脲(Iodogen)放射性碘化标记法合成1I-anti-TLR5McAb,经Sephadex G-25柱分离纯化,纸层析检测其标记率和放射化学纯度。6、检测1I-anti-TLR5McAb的体外稳定性。7、研究H22细胞体外对1I-anti-TLR5McAb的摄取情况。8、对H22细胞进行1I-anti-TLR5McAb体外受体结合分析。9、注射后的不同时间1I-anti-TLR5McAb后对荷瘤鼠分别进行放射自显影显像和体内生物学分布实验。实验结果1、RT-PCR和免疫组化结果表明TLR5的mRNA和蛋白在H22移植瘤部位均高表达。2、CCK-8结果显示,rFliC与FLA单用或联合应用均可明显抑制H22细胞的增殖,并呈浓度相关性；联合应用抑制作用明显增强,与单独用药组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3、流式细胞术分析显示rFliC、FLA单独作用,均能诱导H22细胞凋亡；联合应用时诱导凋亡作用显著增强(P<0.01)。4、成功制备肝癌H22荷瘤小鼠模型。5、用Iodogen法进行放射性碘标记anti-TLR5McAb,制备方法简便迅速,标记率高,放射化学性质稳定,标记率达95.19%,纸层析法测得放化纯为96.46%,体外稳定性高。6、细胞体外摄取实验显示：经过6、12、24、48h孵育后,H22细胞对131I-anti-TLR5McAb的摄取率均明显高于对照组Na131I的摄取率(P<0.05)。7、细胞受体结合实验测得H22细胞的亲和力Kd值为(2.81±0.05) nmol/L,最大结合位点Bmax值为(4.65±0.09)μmol／L。8、体内生物学分布实验显示’31I-anti-TLR5McAb主要通过肝、肾代谢,其他器官放射性较低,肿瘤部位的放射性摄取明显高于正常肝脏组织。实验组在注射6h时%ID/g为(6.51±0.63),12h时达高峰,为(8.03±0.42),而对照组摄取高峰时的%ID/g较低,仅为(3.83±0.26)。9、磷屏放射自显影图像显示,实验组在注射131I-anti-TLR5McAb后24h即可获得清晰放射自显影图像,荷瘤鼠的移植瘤部位放射性浓聚明显,肿瘤靶向性良好。研究结论TLR5在肝癌细胞株H22中高表达,TLR5激动剂-鞭毛蛋白可以明显抑制H22细胞的增殖、促进凋亡,并呈浓度依赖方式。研究结果为以TLR5为靶点进行肝癌治疗奠定了实验基础。放射性碘化标记的1I-anti-TLR5McAb制备简便、生物学性质稳定,标记率高,在肝癌荷瘤小鼠中肿瘤靶向性分布明显,且在靶组织中清除缓慢,放射自显影图像质量好,可作为一种新型分子探针监测肝癌的发生发展,并有望用于其他TLR5表达阳性的肿瘤显像。