多酚与花生蛋白相互作用及其对花生蛋白致敏性的影响

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花生(Arachis hypogaea Linn)是一种分布广泛、营养丰富的植物资源,然而,其中含有的花生致敏蛋白常常引起食物过敏。花生过敏是一种典型的Ig E介导的过敏反应,常见症状涉及皮肤、呼吸道、消化系统等,严重时可危及生命,目前有研究证明植物多酚与花生蛋白结合后可以降低花生致敏作用。为进一步解析多酚缓解花生蛋白致敏作用机制及构效关系,本论文利用光谱学技术研究多酚与花生蛋白结合后的光谱行为变化,通过测定复合物的粒径与电位、可溶性蛋白含量、表面疏水性、扫描电镜图、差示扫描量热图解析其结构与性质的变化,分析不同结构多酚及其在不同p H条件下与花生蛋白的相互作用、蛋白结构特征以及脱敏效果,为深入开发低致敏性花生产品提供更多理论基础。本文主要研究内容及结果如下:(1)利用紫外光谱、内源荧光光谱、同步荧光光谱初步探究了花生蛋白与6种多酚间的相互作用。反式肉桂酸、反式阿魏酸、柚皮素、金雀异黄酮与花生蛋白间的相互作用力类型为疏水相互作用,咖啡酸、槲皮素与花生蛋白间的相互作用力类型为氢键和范德华力。反式肉桂酸和槲皮素均使花生蛋白中的发色氨基酸残基周围环境疏水性增加,极性减小,蛋白结构可能更加紧凑。反式阿魏酸、咖啡酸、柚皮素和金雀异黄酮均使花生蛋白中的发色氨基酸残基周围环境亲水性与极性增加,蛋白结构可能变得更加松散。(2)利用花生致敏蛋白检测试剂盒测定花生蛋白中添加不同种类多酚后的致敏性变化情况,结果表明:反式肉桂酸、反式阿魏酸、咖啡酸、柚皮素、金雀异黄酮、槲皮素与花生蛋白结合后表现出较好的体外Ig E结合抑制能力,酚酸处理组的抑制能力更强。SDS-PAGE与可溶性蛋白含量测定结果表明:6种多酚与花生蛋白结合后,引起一些蛋白条带消失或减少,可溶性蛋白含量下降,其中,酚酸处理组的变化程度更大。(3)利用多光谱、可溶性蛋白含量、粒径与电位、表面疏水性、差式扫描量热图、扫描电镜图等表征不同结构的多酚与花生蛋白的相互作用及蛋白结构变化。结果表明,6种多酚与花生蛋白均发生了相互作用,花生蛋白结构改变。氢键、静电相互作用和疏水作用力参与了多酚与花生蛋白的相互作用,作用位点更靠近色氨酸残基。总体而言,添加酚酸比添加黄酮对花生蛋白影响更大。酚酸处理组表现出显著下降的可溶性蛋白含量,显著降低的平均颗粒粒径,更疏松的结构,其复合物表面均出现沟壑。总体上,多酚与花生蛋白相互作用引起了二级结构从α-螺旋和β-转角向β-折叠的转变。(4)采用分子对接模拟花生致敏蛋白Ara h 1与多酚间的相互作用。结果表明,6种多酚结合在该蛋白结构中的不同位点上。其中,Ara h 1与反式阿魏酸、金雀异黄酮、槲皮素间的相互作用均有酪氨酸参与。反式阿魏酸与Ara h 1的相互作用涉及两个关键的脱敏氨基酸:Ala-502和Arg-503。(5)利用多光谱、可溶性蛋白含量、粒径与电位、表面疏水性、差式扫描量热图、扫描电镜图、Ig E结合抑制率等表征不同p H下槲皮素/肉桂酸与花生蛋白的相互作用、蛋白结构及花生蛋白致敏性变化。结果表明:不同p H下槲皮素/肉桂酸与花生蛋白的相互作用不同,对蛋白结构的影响不同,对花生蛋白致敏性产生不同效果。多酚与花生蛋白相互作用导致后者致敏性下降可能与蛋白含量减少,部分氨基酸残基疏水性下降、结构展开,蛋白二级结构中α-螺旋和/或β-转角含量下降,蛋白结构更加松散有关。致敏性变化可能是多项指标共同作用的结果。(6)分子模拟结果表明:高p H不利于花生致敏蛋白Ara h 1结构的稳定,也可能不利于多酚与该蛋白的结合,这可能是由于蛋白局部结构变得更加紧凑造成的。分子对接结果表明:p H 7时的反式肉桂酸、p H 9时的槲皮素/反式肉桂酸与花生致敏蛋白Ara h 1相互作用时均涉及到与脱敏有关的关键氨基酸。
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