论文部分内容阅读
目的硒（Selenium,Se）具有抗氧化和抗炎特性,是人体和动物必需的微量元素。丝氨酸（Serine）是人体的非必需氨基酸,Serine有着多种生理作用,其中最重要的作用是作为蛋白质中的磷酸化位点。除了在蛋白质合成中的作用外,Serine还在多种细胞反应中起着至关重要的作用,也是许多重要代谢物质的前体。这些代谢物包括一种对核苷酸从头合成至关重要的一碳单位,以及对磷脂至关重要的神经酰胺和神经递质。机体内的Serine来源包括4个方面:膳食的摄入;机体大分子（包括蛋白质和磷脂）的降解;糖代谢旁路——Serine的从头合成途径;甘氨酸（Glycine）的转化。早期研究已经揭示,正常情况下,当膳食摄入蛋白质或Serine不足时,机体可以依靠内源性合成Serine来实现补偿。早期研究证明,在肿瘤细胞中,Serine的从头合成途径（de novo synthesis）被激活,肿瘤细胞的Serine生物合成主要方式是L-Serine的从头合成途径,这与肿瘤细胞的存活与增殖密切相关。细胞在癌变时,Serine从头合成途径的关键酶3-磷酸甘油酸脱氢酶（3-Phosphoglycerate Dehydrogenase,PHGDH）高表达,致使其代谢途径变得异常活跃,来合成更多的内源性Serine,来提供更多的Glycine和一碳单位,用于核酸的合成从而促进细胞的分裂和增殖。但是,在细胞正常情况下,当膳食中摄入蛋白质或Serine不足时,机体主要依靠内源性合成Serine来实现补偿。而内源性Serine的合成主要路径是通过丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxylmethyltransferases,SHMT）一步直接从Glycine转化而来。在动物和人体内,硒蛋白的合成必须有Serine的参与,过表达则必然利用大量的Serine;过量的硒排泄时,也要消耗Serine用于合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）而提供甲基;大量研究表明,当摄取超营养水平的硒时,机体内硒蛋白可过量表达而出现胰岛素抵抗（IR）,但机制不明。基于硒蛋白中硒代半胱氨酸（Selenocysteine,SeCys）的碳骨架只能来自另一种氨基酸（Serine）并结合细胞癌变时发现Serine从头合成途径可异常活跃地合成Serine,因此,我们提出如下新假说:在正常情况下,当摄取超营养水平硒时,机体Serine从头合成途径也变得高度活跃地合成Serine,用于合成硒蛋白或排泄过剩的Se从而导致糖代谢紊乱。糖尿病发病机制与胰岛素相关信号转导通路相关密切,这些信号转导通路致使胰岛素无法与正常激活的受体结合,从而引起了血糖的变化。其中AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）信号通路作为一个调控糖脂代谢的关键枢纽,在研究糖尿病的分子机制中有着不可替代的作用。本研究通过体外培养细胞从分子水平进一步验证Serine对硒蛋白合成的协同作用以及初步探讨高硒环境培养细胞内的糖代谢旁路——L-Serine从头合成是否被激活,糖代谢通路自身发生异常,导致糖代谢紊乱,并探讨Serine从头合成被激活的可能。方法（1）高Se胁迫下（正常细胞培养液中添加不同浓度的硒代蛋氨酸（Selenomethionine,SeMet））观察在不同细胞系中硒蛋白表达的情况以及Serine的协同作用。具体实验方案:培养肝细胞L02细胞,肝癌细胞HepG2细胞和结肠癌细胞HCT-116细胞,将其分为SeMet组和Serine+SeMet组。SeMet剂量设为0.001,0.01,0.1,1 和10 μmol/L。Serine 和 SeMet 按照 2:1 摩尔比混合（Serine:SeMet=2:1）。SeMet和Serine作用于三种细胞系48 h后,收集细胞培养的上清液和裂解液。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,ELISA）双抗体夹心法检测细胞上清液中硒蛋白P（Selenoprotein P,SELENOP）的浓度和裂解液中的谷胱甘肽过氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1,GPx1）浓度。采用 Western Blotting 检测裂解液中的 SELENOP和GPx1的表达水平。（2）高Se胁迫下,观察在不同细胞系中内源性Serine合成通路关键酶表达的情况。具体实验方案:培养肝细胞L02细胞,肝癌细胞HepG2细胞和结肠癌细胞HCT-116 细胞,将 SeMet 的剂量设为0.001,0.01,0.1,1 和 10μmol/L。SeMet 作用于三种细胞系48 h后,收集细胞培养裂解液。采用Western Blotting检测裂解液中关键酶PHGDH和SHMT1表达水平。（3）观察外源性Serine或Glycine在不同细胞系中硒蛋白表达和Serine内源性合成代谢通路关键酶表达的影响。具体实验方案:培养肝细胞L02细胞,肝癌细胞HepG2细胞和结肠癌细胞HCT-116细胞,将SeMet的浓度固定为0.01 μmol/L进行Serine或Glycine干预实验。Serine或Glycine干预剂量设为生理盐水对照,0.4,0.8,1.6,3.2和6.4 mmol/L。Serine或Glycine作用于三种细胞系48h后,收集细胞培养的裂解液。采用Western Blotting检测裂解液中硒蛋白SELENOP和GPx1表达水平和Serine内源性合成代谢通路关键酶PHGDH和SHMT1的表达水平。（4）将正常肝细胞中SeMet的浓度细化,进一步观察L02细胞中硒蛋白、内源性Serine合成通路关键酶和糖代谢信号转导通路关键因子的表达。具体实验方案:培养肝细胞L02细胞,将SeMet设为对照组（生理盐水）,0.001,0.005,0.01,0.025,0.05,0.075,0.1,0.25,0.5,1 和 10 μmol/L 12 个剂量组。采用酶联免疫吸附试验（ELISA实验）双抗体夹心法检测细胞上清液中SELENOP的浓度和裂解液中的GPx1浓度。采用Western Blotting检测裂解液中硒蛋白SELENOP和GPx1,PHGDH和SHMT1及AMPK的表达水平。结果（1）高Se胁迫下（正常细胞培养液中添加不同浓度的SeMet）观察在不同细胞系中硒蛋白表达的情况以及Serine的协同作用实验中我们观察到:在L02细胞中,SeMet与GPx1和SELENOP表达在低浓度时具有剂量效应,SeMet浓度为1μmol/L和0.1μmol/L时,GPx1和SELENOP表达分别达到拐点,SeMet浓度进一步升高为10μmol/L时,GPx1和SELENOP表达出现下降。WB结果显示,SeMet 剂量为 0.001～10μmol/L 时,Serine 对细胞内 GPx1 和 SELENOP 表达具有协同作用。在HepG2细胞中,SeMet剂量为0.001～10μmol/L时,ELISA结果和WB结果均显示SeMet与GPx1和SELENOP表达具有剂量效应关系,且Serine对细胞内GPx1和SELENOP表达具有协同作用。在HCT-116细胞中,SeMet与GPx1和SELENOP表达没有剂量效应关系。（2）高Se胁迫下,在不同细胞系中内源性Serine合成通路关键酶表达情况的实验中我们观察到:在L02细胞中,SeMet与PHGDH和SHMT1表达在低浓度时具有剂量效应关系,SeMet浓度为0.1μmol/L时,PHGDH和SHMT1表达均达到拐点,SeMet浓度进一步升高为10μmol/L时,PHGDH和SHMT1表达出现下降。在HepG2细胞中,SeMet浓度为0.001～1 μmol/L时,PHGDH的合成随SeMet浓度升高而升高,SeMet浓度为0.001～10μmol/L时,SHMT1的合成随SeMet浓度升高而下降,出现反馈抑制现象。在HCT-116细胞中,PHGDH和SHMT1的合成均不随SeMet浓度变化。（3）在外源性Serine或Glycine影响不同细胞系硒蛋白表达和Serine内源性合成代谢通路关键酶表达实验中我们观察到:在L02细胞中,GPx1和SELENOP的合成随Serine浓度升高而升高,呈现剂量效应关系,Serine浓度为3.2mmol/L时达到拐点,Serine浓度进一步升高到6.4mmol/L时,GPx1和SELENOP的合成开始下降;当Serine浓度为0.4～6.4mmol/L时,PHGDH和SHMT1的合成随Serine浓度升高而降低。Glycine浓度为0.4～6.4mmol/L时,GPx1和SELENOP的合成随Glycine浓度升高而升高,呈现剂量效应关系,当Glycine浓度为0.4～6.4mmol/L时,PHGDH和SHMT1的合成随Glycine浓度升高而降低。在HepG2细胞中,Serine浓度为0.4～6.4mmol/L时,GPx1和SELENOP的合成随Serine浓度升高而升高,呈现剂量效应关系,当Serine浓度为0.4～6.4mmol/L时,PHGDH和SHMT1的合成随Serine浓度升高而降低。Glycine浓度为0.4～6.4mmol/L时,GPx1和SELENOP的合成随Glycine浓度升高而升高,呈现剂量效应关系,当Glycine浓度为0.4～6.4mmol/L时,PHGDH和SHMT1的合成随Glycine浓度升高而降低。在 HCT-116 细胞中,Serine 或 Glycine 浓度为 0.4～6.4mmol/L 时,硒蛋白 Gpx1和SELENOP的合成或PHGDH和SHMT1的表达均不随Serine或Glycine浓度变化而变化。（4）将正常肝细胞中SeMet的浓度细化,进一步观察L02细胞硒蛋白、内源性Serine合成通路关键酶和AMPK表达:ELISA结果显示,SeMet与GPx1和SELENOP表达在低浓度时具有剂量效应关系,SeMet浓度为0.05μmol/L和0.1 μmol/L时,GPx1和SELENOP表达分别达到拐点,SeMet浓度进一步升高为10μmol/L时,GPx1和SELENOP表达出现下降。WB结果也显示,SeMet与GPx1和SELENOP表达在低浓度时具有剂量效应关系,SeMet浓度为0.075μmol/L和0.05μmol/L时,GPx1和SELENOP表达分别达到拐点,SeMet浓度进一步升高为 10μmol/L 时,GPx1 和 SELENOP 表达出现下降。SeMet 与 PHGDH 和 SHMT1表达在低浓度时具有剂量效应关系,SeMet浓度为0.05μmol/L时,PHGDH和SHMT1表达均达到拐点,SeMet浓度进一步升高为10μmol/L时,PHGDH和SHMT1表达出现下降。SeMet浓度为0.001-1μmol/L时AMPK表达随SeMet浓度升高而升高。结论1.以现有三种细胞系来看,基于细胞内硒蛋白合成首先必须有Serine参与硒代半胱氨酸的从头合成,HepG2细胞本身Serine从头合成途径已被过度激活,HCT-116细胞不能合成内源性Serine,因此,L02细胞最适合于用于体外硒蛋白表达与调控的研究。2.从体外细胞实验来看,高硒胁迫下,L02细胞内内源性从头合成Serine通路的关键酶PHGDH可以被激活,合成内源性Serine,用于合成大量硒蛋白,但SHMT1作为Serine与Glycine相互转化的催化酶同样可以被激活,是用于合成内源性Serine还是内源性Serine继续生成Glycine用于合成GSH作为含硒酶的底物或生成SAM用于解毒有待进一步确定。3.外源性Serine和Glycine均能反馈抑制PHGDH和SHMT1,进一步证实高硒胁迫下,细胞合成大量的内源性Serine和Glycine,继而用于合成硒蛋白或者是GSH或者是SAM。4.从体外细胞实验的结果来看,高硒胁迫下,L02细胞内AMPK表达增强,且呈现明显的剂量效应关系,可能表明细胞内的能量代谢和氨基酸代谢都出现了重组。