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镉(Cd)是环境中一种常见的有毒重金属污染物,被广泛应用于工业生产。Cd是高度累积的毒物,具有很长的生物半衰期,对动物机体损伤严重。Cd一旦被生物体吸收,能够对肾脏,肝脏,睾丸和脾脏等器官产生强烈的毒性作用。其中肾脏是Cd蓄积的主要部位,尤其是肾皮质,Cd主要损伤近端小管上皮细胞,引起肾毒性。前期研究表明葛根素(PU)在重金属铅致大鼠近端小管上皮细胞损伤中有保护效果,但在Cd致肾损伤中的保护作用尚未报道。因此,本试验以PU作为Cd中毒的保护剂,从细胞自噬、溶酶体功能和氧化应激三个方面对PU的保护效应进行探讨。本试验通过建立原代大鼠近端小管上皮细胞(rPT)体外模型,在Cd染毒期间进行不同浓度的PU共处理12 h,进行以下指标的检测。首先,采用CCK-8法检测细胞存活率及通过相差显微镜观察处理后rPT细胞的形态学变化。结果发现浓度为100μM的PU对2.5μMCd致细胞毒性的保护效果最佳。第二,探讨PU能否恢复Cd所致rPT细胞自噬抑制。免疫印迹技术检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结合瞬时转染RFP-GFP-LC3和GFP-LC3质粒进行激光共聚焦显微镜观察,发现PU处理显著缓解Cd导致的自噬流阻滞,显著减轻了Cd诱导的自噬体累积,表明PU能够缓解Cd致rPT细胞的自噬抑制。第三,鉴于溶酶体在细胞自噬过程中发挥的关键作用,本研究进一步探讨PU对溶酶体功能的影响。分别通过Lyso-Tracker-Red和AO染色发现PU明显缓解Cd诱导的溶酶体碱化;分别通过DQ-BSA荧光染色和免疫印迹技术检测CTSD蛋白表达水平变化发现PU显著缓解Cd导致的溶酶体降解功能损伤,证实PU可以恢复Cd诱导的溶酶体功能障碍;最后通过免疫荧光染色技术检测溶酶体膜标志性蛋白LAMP-1和溶酶体内标志性水解酶CTSD共定位情况,结合Lyso-Tracker-Red和AO染色结果发现PU有效阻断Cd诱导的溶酶体膜通透化(LMP)的发生。以上结果表明PU可恢复Cd致溶酶体功能异常。第四,本研究探讨了PU对Cd致rPT细胞氧化应激的影响。分别通过流式细胞术和化学比色法及激光共聚焦显微技术检测胞内ROS和MDA的水平和DHE荧光强度变化发现PU处理能显著缓解Cd致细胞内氧化应激;为进一步明确氧化应激在PU拮抗Cd致细胞毒性中的作用,本研究检测了Nrf2-Keap1通路,采用免疫荧光染色法检测Nrf2核转位,免疫印迹法检测Nrf2核蛋白、Nrf2内源性抑制剂Keap1以及Nrf2-Keap1通路下游信号分子(HO-1、NQO1)蛋白表达水平的变化,发现PU显著抑制Cd诱导的Nrf2核转位及Nrf2-Keap1通路的激活。同时,PU处理显著下调了rPT细胞中Cd诱导的抗氧化酶(CAT、SOD、GPx)相关蛋白和GSH合成相关蛋白(GCLM、GCLC、GR)表达水平的升高,进一步表明PU显著缓解Cd致rPT细胞氧化应激。综上所述,PU可通过恢复自噬流阻滞来缓解自噬抑制,通过改善溶酶体内环境,阻断溶酶体膜通透化恢复Cd导致的溶酶体功能损伤;通过抑制Nrf2-Keap1途径的激活缓解氧化应激来减轻rPT细胞中Cd诱导的细胞毒性;PU的抗氧化性能在拮抗Cd致自噬抑制和溶酶体功能损伤中发挥重要作用。本研究为进一步开发PU作为肾脏保护剂提供重要理论依据。