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目的:系统论述肾虚血瘀与绝经后骨质疏松症的相关性,明确补肾益气活血治法及其方药对绝经后骨质疏松症的治疗效果及其作用机制,有助于阐明调节骨形成的新方法和开发有效的改善骨代谢的方剂,为临床防治绝经后骨质疏松症提供理论和实验依据。材料与方法:第一部分:理论研究通过文献整理及理论分析方法,从肾的精气、血、阴、阳方面论述其与骨的密切关系,阐释绝经后骨质疏松症的发病根本病机,并从来源和功能两方面论述肾精和骨髓间充质干细胞之间的相关性,进一步探究补肾益气活血为绝经后骨质疏松症的重要治法。第二部分:体内实验将90只SPF级SD雌性大鼠随机分为正常组、模型空白组、补肾益气活血方高剂量组、补肾益气活血方低剂量组、福善美组,共5组,每组各18只。采用一次性摘除大鼠双侧卵巢法建立绝经后骨质疏松症动物模型,正常组不进行手术。正常组和模型空白组大鼠给予0.9%生理盐水灌胃,其余各组给予相应药物灌胃,模型空白组及治疗组大鼠从手术结束后第二天开始给药,每日1次,共12周。在最后一次灌胃后,麻醉、开腹手术,从腹主动脉取血,以3000r/min离心15分钟,取血清,取出肾脏和左后肢股骨,用双能X线检测各组大鼠左后肢股骨骨密度,ELISA法检测大鼠血清ALP、TRACP表达,应用qRT-PCR法及ELISA法检测骨及肾组织Wnt7b、Axin2、Runx2 mRNA及蛋白表达,用Western法检测骨及肾组织Runx2、β-catenin蛋白表达。第三部分:体外实验实验药物:淫羊藿苷和地黄苷D分别为补肾中药淫羊藿和生地黄的有效成分,鹿茸提取液为本实验室用鹿茸冻干粉自制,黄芪甲苷为益气中药黄芪的有效成分,羟基红花黄色素A为活血中药红花的有效成分。实验将大鼠骨髓间充质干细胞分为以下9组:正常组、成骨诱导组、补肾组、益气活血组、补肾益气活血组、成骨诱导+DKK-1组、补肾+DKK-1组、益气活血+DKK-1组、补肾益气活血+DKK-1组。指标检测:用茜素红染色法观察第15d矿化结节形成,用qRT-PCR法检测Wnt7b、Axin2、Runx2 mRNA表达,ELISA法检测Wnt7b、Axin2、Runx2蛋白表达。结果:第一部分:理论研究绝经后骨质疏松症的根本病位在骨,肾虚血瘀为其常见证候之一,从“肾虚血瘀”立论,肾精亏虚,则肾之气血阴阳失调,因虚致瘀,骨髓不生,髓减骨枯,导致绝经后骨质疏松症的发病。补肾益气活血治法通过补肾调理气血,通过益气促进活血,两者相互协同,达到改善肾虚血瘀的病机变化,是防治绝经后骨质疏松症的有效治法。第二部分:体内实验1.骨密度结果显示:与正常组相比较,模型空白组左后肢股骨骨密度显著降低(P<0.01),与模型空白组相比较,各治疗组骨密度均有不同程度的增高(P<0.01)。2.骨代谢指标结果显示:与正常组相比较,模型空白组血清ALP和TRACP水平明显升高(P<0.01);与模型空白组相比较,各用药组血清ALP和TRACP水平均明显降低(P<0.01),其中福善美组降低最明显,补肾益气活血方高剂量组次之(P<0.01)。3.qRT-PCR结果显示:与正常组相比较,骨及肾组织的模型空白组的Wnt7b、Axin2、Runx2的mRNA的相对表达量明显下调(P<0.05);与模型空白组相比较,骨及肾组织的补肾益气活血方高剂量组和福善美组的Wnt7b、Axin2、Runx2的mRNA的相对表达量明显上调(P<0.05);补肾益气活血方高剂量组与低剂量组相比较,骨及肾组织的Wnt7b、Axin2的mRNA的相对表达量明显上调(P<0.05),肾组织的Runx2的mRNA相对表达量明显上调(P<0.05),而骨组织的Runx2的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。4.ELISA结果显示:与正常组相比较,骨及肾组织的模型空白组的Wnt7b、Axin2、Runx2蛋白表达均明显下调(P<0.01);与模型空白组相比较,骨及肾组织的补肾益气活血方高剂量组和福善美组的Wnt7b、Axin2、Runx2蛋白表达均明显上调(P<0.01)。5.Western结果显示:与正常组相比较,骨及肾组织的模型空白组的Runx2、β-catenin蛋白表达明显下调(P<0.05);与模型空白组相比较,骨及肾组织的福善美组与补肾益气活血方高剂量组Runx2、β-catenin蛋白表达均明显上调(P<0.05);补肾益气活血方高剂量组与低剂量组相比较Runx2、β-catenin蛋白表达明显上调(P<0.05)。第三部分:体外实验1.15d的茜素红染色结果显示:成骨诱导组的矿化结节数目最多,体积较其他组大;补肾组、益气活血组以及补肾益气活血组的矿化结节均较正常组多,且体积明显增大,其中以补肾益气活血组的矿化结节最多。成骨诱导组、补肾组、益气活血组和补肾益气活血组在加入DKK-1之后,矿化结节数量明显减少,体积偏小,矿化水平降低。2.qRT-PCR结果显示:与正常组相比较,成骨细胞在成骨诱导组、补肾益气活血组和补肾益气活血+DKK-1组的Wnt7b、Axin2和Runx2的mRNA相对表达量上调(P<0.05);与成骨诱导组相比较,成骨细胞在成骨诱导+DKK-1组和益气活血+DKK-1组的Wnt7b mRNA相对表达量下调(P<0.05),补肾组、益气活血组、成骨诱导+DKK-1组、补肾+DKK-1组和益气活血+DKK-1组的Axin2 mRNA相对表达量下调(P<0.05),益气活血组、成骨诱导+DKK-1组和益气活血+DKK-1组的Runx2 mRNA相对表达量下调(P<0.05);补肾组、益气活血组以及补肾益气活血组加入DKK-1后Wnt7b、Axin2和Runx2的mRNA相对表达量均下调(P<0.05)。3.ELISA结果显示:与正常组相比较,成骨细胞在成骨诱导组、补肾组和补肾益气活血组的Wnt7b、Axin2和Runx2蛋白表达上调(P<0.05);与成骨诱导组相比较,成骨细胞在益气活血组、补肾益气活血组、成骨诱导+DKK-1组、补肾+DKK-1组、益气活血+DKK-1组和补肾益气活血+DKK-1组的Wnt7b、Axin2和Runx2蛋白表达下调(P<0.05);补肾组、益气活血组以及补肾益气活血组加入DKK-1后Wnt7b、Axin2和Runx2的蛋白表达均下调(P<0.05)。结论:1.肾虚为绝经后骨质疏松症发病的根本病机,血瘀为绝经后骨质疏松症的关键病机。补肾益气活血治法及其复方通过益气补肾生精,促进气血运行,调节阴阳平衡,从而改善绝经后骨质疏松症肾虚血瘀的病机变化,标本兼顾,理论依据充分。2.补肾益气活血方可以提高绝经后骨质疏松症大鼠股骨骨密度,显著降低血清ALP和TRACP的表达水平,并呈剂量相关,表明补肾益气活血方能改善绝经后骨质疏松症大鼠骨密度及骨转换率,从而有效防治绝经后骨质疏松症。3.补肾益气活血方的作用机制是上调绝经后骨质疏松症大鼠骨和肾组织Wnt7b、Axin2及Runx2 mRNA及蛋白表达,且上调骨和肾组织的β-catenin蛋白表达,呈剂量相关,通过上调Wnt7b/β-catenin信号通路相关因子以促进成骨分化,从而对绝经后骨质疏松症起到防治作用。4.补肾益气活血有效组分功能配伍增强矿化结节的形成,可以促进BMSCs成骨分化,起到维持正常骨量的作用。5.补肾益气活血有效组分功能配伍能够上调Wnt7b/β-catenin信号通路中Wnt7b、Axin2以及Runx2 mRNA及蛋白表达以促进BMSCs成骨分化。