1．目的脓毒症(Sepsis)是由感染因素引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)，是临床病人发生感染后的常见并发症，并已成为导致临床危重症患者死亡的首要因素，目前尚无有效的药物用于临床治疗。为研发有效的治疗脓毒症药物，本实验室以介导细菌脓毒症的主要病原体相关分子——细菌脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide, LPS)和细菌CpG DNA为靶标，应用基于生物传感器的筛选和定向分离技术，从地骨皮药材中定向分离得到一个能同时拮抗LPS和CpG DNA的生物碱类化合物苦柯胺B。由于天然提取物产率低，无法满足临床用药需求，为此我们对该化合物进行了全化学合成，制备获得了该化合物的药用盐——甲磺酸苦柯胺B(Kukoamine B，KB)。前期研究证实，该化合物能够显著提高脓毒症模型小鼠的存活率，降低其血中LPS和炎症介质TNF-α的水平。由于从小鼠模型中获取的标本(尤其是血液样品)不足以支持治疗脓毒症药物深入的药效学和作用机制的研究，因此，为满足KB作为原创新药申报国家1.1类化药的药效学研究的需要，本研究通过探索、改进建模方法，建立了成熟稳定的盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)大鼠脓毒症模型，并应用该模型研究了KB治疗脓毒症的药理作用及机制，为其临床前研究奠定基础。2．方法2.1标准化CLP脓毒症大鼠模型的建立及首次使用抗菌药物时间的确定2.1.1稳定的CLP脓毒症模型术式的筛选与建立：比较自制三棱针与传统穿刺针、传统穿刺针+引流条、传统穿刺针+引流管等不同穿刺方法建模后大鼠死亡率的稳定性差别。2.1.2不同死亡率CLP脓毒症模型大鼠的建立：采用3、4、5号三棱针(边径分别为3、4和5mm)穿刺建模，观察大鼠死亡率；确定死亡率为70%－90%CLP大鼠脓毒症模型用于药物保护实验；确定死亡率为30%－50%的CLP大鼠脓毒症模型用于药物治疗实验。2.1.3CLP脓毒症大鼠模型首次抗菌药物使用时间点的筛选：在死亡率为70%－90%的CLP大鼠脓毒症模型中，分别于术后0、1、2、3、4、5、6、7、8h首次静脉注射抗菌药物(100mg/kg舒氨西林+甲硝唑5mg/kg)，观察大鼠死亡率，确定利于药物疗效观察的抗菌药物首次给药时间。2.2KB对CLP脓毒症大鼠模型的保护作用：建立死亡率为70%－90%的CLP大鼠模型，在抗菌、补液治疗的基础上，给予低、中、高剂量(0.3、1和3μg/kg)的KB，选用乌司他丁(10000U/kg)作为对照药物，观察KB对CLP脓毒症大鼠模型的保护作用。2.3KB对CLP脓毒症模型大鼠的治疗作用：建立死亡率为30%－50%的CLP脓毒症大鼠模型，在抗菌、补液治疗的基础上，分别给予中、高剂量(1和3μg/kg)的KB以及乌司他丁(10000U/kg)。在CLP术后4、8、12、24h采集血液标本，检测各时相点血中的细菌量、LPS和炎症介质(TNF-α和IL-6)、血常规、凝血和血生化指标的变化情况。在术后24h采集肺组织和小肠组织，光镜下观察组织病理改变，以评价KB对CLP脓毒症模型大鼠的治疗作用。2.4KB改善CLP脓毒症大鼠模型急性肺损伤的作用及其机制研究2.4.1体外实验：分离大鼠外周血嗜中性粒细胞，检测分析KB与乌司他丁干预LPS刺激嗜中性粒细胞后，对炎症介质信号分子和转录因子活化以及炎症介质TNF-α、IL-6和弹性蛋白酶的表达的影响，探讨KB改善CLP脓毒症模型大鼠急性肺损伤的机制。2.4.2体内实验：建立死亡率为30%－50%的CLP脓毒症大鼠模型，在抗菌、补液治疗的基础上，分别给予高剂量(3μg/kg)的KB以及乌司他丁(10000U/kg)。术后12、24h取肺组织，检测肺干湿重，检测肺组织中信号分子(IκB-α和p38)和转录因子(NF-κB)活化情况、炎症介质TNF-α、IL-6和弹性蛋白酶的表达变化。3.结果3.1自制三棱针较传统穿刺针可更好地建立稳定的CLP脓毒症大鼠模型3.1.1自制三棱针较传统穿刺针建立的CLP脓毒症大鼠模型动物组间死亡率差异小：自制三棱针穿刺建立的CLP脓毒症大鼠模型动物组间死亡率差异不超过10%，而采用传统穿刺针、穿刺针+引流条、穿刺针+引流管和锥形三棱针的方法建立的CLP脓毒症大鼠模型动物的组间死亡率差异可高达50%、60%、50%和40%。说明采用自制三棱针较传统穿刺针可更好地建立稳定的CLP脓毒症大鼠模型。3.1.2自制三棱针的边径与模型动物的死亡率成正相关：3#针组为20%－30%，4#针组为30%－50%，5#针组为70%－90%。建立死亡率为70%-90%的大鼠CLP脓毒症模型主要条件为：盲肠结扎1.6cm，用5号三棱针穿刺1孔；建立死亡率为30%－50%的大鼠CLP脓毒症模型主要条件为：盲肠结扎1.6cm，用4号三棱针穿刺1孔。3.1.3在CLP脓毒症模型大鼠中确定首次使用抗菌药物的时间为术后7h：在死亡率为70%－90%的CLP脓毒症模型大鼠中，抗菌药物首次使用时间为术后5h以内，可显著提高大鼠存活率(P<0.05或0.01)，当抗菌药物首次使用时间为术后6h－8h，单独抗菌已不能提高大鼠的存活率(P>0.05)，可模拟临床抗菌药物无效的情况，有利于目标药物药理作用的观察，因此本研究中将抗菌药物首次使用时间确定为术后7h。3.2KB可显著提高CLP脓毒症模型大鼠的生存率生理盐水(NS)组大鼠7天生存率为13.33%，抗菌药物组为36.67%，二者无统计学差异(P＞0.05)。对照药物乌司他丁组大鼠生存率为63.33%，与抗菌药物组比较具有显著的统计学差异(P<0.05)。低、中、高剂量的KB(0.3、1和3μg/kg)组可显著提高大鼠生存率，由36.67%提高至63.33%、70.00%和86.67%，具有显著和非常显著的统计学差异(P <0.05或0.01vs抗菌药物组)。KB低剂量组的大鼠生存率与乌司他丁组无统计学差异(P＞0.05)，而中高剂量组保护作用优于乌司他丁(P <0.05)。3.3KB对CLP脓毒症大鼠模型具有显著的治疗作用相对于假手术组，NS组大鼠血中可检出细菌，血LPS和炎症介质TNF-α和IL-6水平显著升高，并出现了动脉血pH下降、凝血功能异常(APTT↑、PT↑、PLT↓)、肝、肾功能异常(ALT、AST、TBIL、Cr和BUN↑)和心肌损伤(CK-MB↑)，病理学观察发现肺组织出现出血、水肿等改变，小肠组织出现上皮细胞坏死、脱落、嗜中性粒细胞的浸润为主要特征的急性炎症性损伤。抗菌药物可有效降低大鼠血细菌计数外，但不能改善其他观察指标。但在抗菌、补液治疗的基础上给予KB，可显著降低CLP模型大鼠血中LPS水平、抑制炎症介质TNF-α和IL-6的释放，还可有效减轻大鼠的凝血功能障碍、抑制动脉血pH值降低，并减轻肾脏和心肌功能异常，减轻肺和小肠组织炎症性损伤等症状，效果优于对照药物乌司他丁。3.4KB可减轻CLP脓毒症大鼠模型的急性肺损伤，其机制与抑制炎症介质密切相关。体外实验结果显示，KB可抑制LPS诱导的嗜中性粒细胞胞TNF-α、IL-6、弹性蛋白酶和TLR4等炎症介质和受体的表达，抑制LPS诱导的胞内重要信号转导分子p38、IκB-α活化和转录因子NF-κB活化。体内实验结果显示，KB能显著降低CLP模型大鼠肺干湿重比值，抑制肺组织信号分子p38和IκB-α的活化以及TNF-α、IL-6和弹性蛋白酶的升高。对照药物乌司他丁对大鼠肺损伤也具有一定的减轻作用，但KB的作用强于乌司他丁。4．结论：4.1成功建立了稳定的CLP脓毒症大鼠模型自制三棱针较传统穿刺针可更好地建立稳定的CLP脓毒症大鼠模型，解决了传统CLP脓毒症模型大鼠中由于穿刺引流入腹腔中的菌量不易控制而造成的CLP脓毒症模型重复性差的难题。本方法操作简单、可控，模型大鼠的死亡率稳定、重现性好，可用于后续的药物研究。4.2KB可显著提高CLP脓毒症大鼠模型的生存率，且效果优于乌司他丁。4.3KB可显著降低CLP脓毒症模型大鼠血中LPS浓度，减少炎症介质TNF-α和IL-6的产生，缓解酸中毒，改善凝血状况，对心和肾脏等脏器功能具有显著的保护作用，且效果优于乌司他丁。4.4KB可减轻CLP脓毒症大鼠模型的急性肺损伤，其机制与抑制炎症介质密切相关。