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为了建立氰戊菊酯农药残留免疫分析快速检测方法,本实验利用自主合成的人工抗原免疫BALB/c小鼠,半固体HAT培养基筛选出二株灵敏度高、特异性强的杂交瘤细胞株,经过进一步ELISA条件优化及添加回收试验,证明该方法能够满足国内及国外对油料及其它农产品中氰戊菊酯农药残留限量要求的检测,研究结果如下:1、本试验先将氰戊菊酯分子结构中间位置的-CN转变成-COOH,后利用酰氯与伯胺的活泼反应,合成了一种含有3个碳原子长度连接臂的氰戊菊酯半抗原。与已报道文献比较,本方法省去了基团(-NH2)保护步骤。该方法合成的氰戊菊酯半抗原,所引入的手臂和活性基团近似位于整个氰戊菊酯分子结构的正中间,意在均衡暴露目标物氰戊菊酸部分和苯环部分的结构特征,以获得较好的免疫效果。2、利用活泼酯法将合成的氰戊菊酯半抗原与载体偶联制备人工完全抗原,紫外-可见连续光谱扫描显示制备的人工抗原的图谱具有载体蛋白和半抗原的特征峰叠加现象,表明偶联成功。以BSA的偶联物免疫小鼠获得抗血清的效价分别为160000、140000、110000,间接竞争ELISA测定抗体IC50为35.1μg/L,对其他供试农药的交叉反应率均<1%。3、通过细胞融合共获得两株单克隆杂交瘤细胞株,分别为5B10和4E3,抗体灵敏度测定IC50值分别为94.5μg/L和19.2μg/L。其中,4E3抗体最低检测限达到了1.02μg/L,检测范围为3.81μg/L～714.94μg/L,对氰戊菊酯结构类似物的交叉反应率均<1%。表明单克隆抗体(4E3)对氰戊菊酯具有很高的灵敏度和特异性。对细胞冻存后的稳定性进行测定,发现细胞存活率基本保持在40%左右。4、选定的二株细胞进行ELISA条件优化,包括抗原抗体包被浓度的选择、离子强度及pH的影响、有机溶剂的影响和不同封闭蛋白影响等五个方面进行考察。实验结果发现,对于抗体4E3,当抗原包被浓度为2μg/mL,1%OVA进行封闭,抗体的稀释浓度为1:32000,离子强度为0.16M,pH值为7.4时,5%甲醇液稀释不同浓度的氰戊菊酯标准品进行间接竞争ELISA检测时,抗体的灵敏度由19.2μg/L提高到17.4μg/L,最低检测限达到了1.02μg/L。5、利用优化的ELISA检测条件建立了氰戊菊酯农药的ELISA标准曲线,检测灵敏度为17.4μg/L,工作范围为3.81μg/L～714.94μg/L。分别测定油菜、青椒、茶叶、小白菜样品的添加回收率,通过比较样品提取液的稀释曲线与标准曲线,计算得四种样品的添加回收率均在80%-90%之间。同时,将ELISA检测结果与气相色谱法进行比较,表明所建立的ELISA检测方法能够基本满足当前氰戊菊酯快速检测的要求。