肿瘤模型动物的人内皮抑素基因治疗初步研究

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本研究利用体外培养的人脑胶质瘤细胞(SHG-44)、人卵巢癌细胞(SKOV3)和COS-1细胞在不同浓度的甘薯糖蛋白作用下,观察细胞形态的变化,以鸡胚成纤维细胞作为阴性对照。甘薯糖蛋白对SHG-44、SKOV3、和COS-1细胞的最小抑制剂量为1.5μg/ml,在第八天出现部分细胞死亡,在第十天全部细胞死亡,而对鸡胚成纤维细胞没有影响。 人内皮抑素(Endostatin、ES)是胶原Ⅹ ⅤⅢ的C端非胶原区(NC1)内的184个氨基酸片段,分子量为20kDa,内皮抑素对新生血管内皮细胞具有特异性的抑制作用,可以抑制肿瘤新生血管的形成,从而可以有效的抑制肿瘤的生长。本研究通过裸鼠皮下移植人卵巢癌(SKOV3)瘤组织建立裸鼠皮下移植瘤模型,并利用自行构建的hES cDNA的真核重组表达载体,对裸鼠皮下移植瘤进行抗血管生成的基因治疗试验。通过高保真聚合酶链式反应(PCR)方法从质粒pGEX-6p-1-ES中扩增出带有人生长激素信号肽序列的hES cDNA。并将hES cDNA克隆入测序载体pGEM-T,进行DNA序列测定。DNA序列测定结果显示:克隆的人内皮抑素cDNA与文献报道的完全一致。包含有重组质粒pGEX-6p-1-ES的重组菌在大肠杆菌表达系统中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,hES cDNA可以在大肠杆菌表达系统中以GST-ES融合蛋白的形式高效表达。将表达产物免疫小鼠,制备多克隆抗血清。将hES cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3中,获得的重组表达载体pcDNA3-ES经脂质体介导转染COS-1细胞,间接免疫荧光检测hES cDNA在COS-1细胞中的表达。间接免疫荧光显示转染后的COS-1细胞的胞浆内有目的蛋白的表达。将重组质粒pcDNA3-ES通过肌肉注射入小鼠体内,获得基因免疫抗体。利用构建的重组表达载体pcDNA3-ES,对裸鼠皮下肿瘤模型进行基因治疗。结果显示,克隆的hES cDNA可以在小鼠体内表达,并对肿瘤生长有抑制作用。
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