肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,其病死率在全球所有癌症中占第3位,在国内居第2位。手术切除仍是目前肝癌获得长期生存的主要手段,但即使是小肝癌根治性切除,5年内仍有60-70%的病人出现转移复发,因此探索肝癌转移复发的机制,寻找有效的抑制途径,探索肝癌术后预测因子,准确区分患者,特别是发现早期肝癌的预后因子已成为进一步提高肝癌生存率的关键。以往大量研究证实,免疫微环境中Th1、Th2及Th17类细胞因子的动态变化在多种人类恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。此前我们与美国国立卫生研究院(NIH)的合作研究构建了包含17个免疫细胞因子的预测模型预测肿瘤复发。本课题组在此基础上进一步采用微流体低密度表达芯片技术(qRT-PCR)对以上预测模型优化后发现癌旁IL-2、IL-15基因表达可以作为早期肝癌术后预后的独立预测因子。以上是基于基因转录水平的研究。周海军等还发现在肝细胞癌患者中,癌周肝组织的高IL-2和IL-15水平与肝内肿瘤复发率的降低和整体生存时间的延长显著相关,但在癌组织中未发现相关趋势,说明免疫微环境对肿瘤进展的作用可能发生在癌周微环境中。然而细胞因子IL-2、IL-15在蛋白水平是否能够影响肿瘤自身生物学特性及其造成影响的相关调节机制尚不明确。另外,我们的前期研究发现调控肝癌转移潜能的基因改变在其原发瘤阶段即已存在,此为转移理论的重要进展。研究还发现骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)表达升高与肝癌迁徙转移能力密切相关。有文献报道OPN可在不同水平调节免疫系统,它可以起类似促炎因子的作用,能够通过增强Thl类细胞因子的表达而调节免疫反应,但是有研究认为OPN对炎症具有双向调节作用,既有促炎效应又有抗炎效应。其不同的亚型或剪接体、不同表达水平、表达时相和不同的组织分布其功能都可能会有所不同。为此,本研究我们在前期研究结果的基础上首先通过免疫组化及ELISA方法在一组包含78例癌旁样本的病例中验证IL-2、IL-15的预测预后价值,发现IL-2、IL-15与肝癌复发相关,并进一步在体内加以验证及探寻其相关调节机制。第一部分IL-2和IL-15对肝细胞癌生长转移的影响目的：前期研究发现,癌旁免疫炎症相关的细胞因子IL-2、IL-15mRNA与肝癌的预后密切有关,本研究的目的是在细胞因子蛋白水平上进一步进行人癌周肝组织水平验证,同时结合评价IL-2、IL-15干预对DEN诱导的大鼠肝细胞癌模型自身特征的改变,通过人体标本和动物实验探讨IL-2、IL-15对肝细胞癌生长转移的影响。方法：应用免疫组织化学染色、ELISA方法分析78例肝细胞癌癌旁肝组织,通过统计学方法评价癌旁微环境中IL-2、IL-15的表达与患者预后的关系。IL-2、IL-15干预DEN诱导大鼠肝细胞癌模型,观察不同时期肿瘤数目、肝重、肺转移灶以及生存状况相关特征变化。结果：78例患者复发组和无复发组与BCLC分期(P=0.02)有关,与镜下癌栓(P<0.0001)显著相关。应用Cox回归模型评估一般临床病理因素对术后复发的风险比发现：单因素分析中肿瘤大小(P=0.036, HR=0.280,95%CI=0.085-0.922);镜下癌栓(P=0.011, HR=2.617,95%CI=1.247-5.494)与复发相关。而多因素分析发现两者均是影响复发的独立因子。组化染色水平上,IL-2、IL-15表达与临床病理特征无明确相关性。IL-2对早期肝癌术后生存复发均有良好的预测效能,癌旁IL-2是预测肝癌复发及生存的独立因素。而IL-15对总体生存(OS)及复发影响均无统计学意义。ELISA检测蛋白浓度水平上,肿瘤分化程度与IL-15浓度水平相关(P=0.016)。用中位数作为分界点时,IL-2、IL-15蛋白浓度水平高低均是影响患者术后生存复发的独立因子。采用Kaplan-Meier法分析发现IL-2(P<0.0001), IL-15(P=0.004)蛋白浓度与TTR显著相关。同样两者对OS均有显著预测效能,低表达的病例预后显著差于高表达的病例(P<0.0001)。ROC曲线进一步验证了78例早期肝癌患者IL-2(AUC=0.756)、IL-15(AUC=0.691)预测复发的效能。体内试验中,实验组100只大鼠,至第16周,死亡11只(11/100),建模成功率为89.0%。另外实验组大鼠体重为302.7±20.2g,而同期正常喂养对照组大鼠体重为408.4±9.9g,两者有明显差异(P<0.05)。给予IL-2、IL-15(20000U/ml)干预大鼠后,IL-2干预组、IL-15干预组大鼠体重较生理盐水模型对照组有明显差异(292.7±20.4g,290.4±18.8g vs274.7±12.5g, Mann-Whitney test, p<0.01),第22周,IL-2干预组、IL-15干预组大鼠存活率较同期盐水对照组有差异[44.4%(4/9),25%(2/8)vs0, logrank P=0.02],而两干预组间无差异(logrank P=0.11).第20周,我们发现IL-2干预组、IL-15干预组较盐水对照组死亡大鼠肝脏表面结节数目[21.5±0.7,23.0±1.4vs28.0±1.4,(P<0.05)]、肝重比(32.0±0.9%,33.2±0.4%vs38.2±0.9%,P<0.05)有统计学差异,且IL-2干预效果更佳。第17周首次观测到受测盐水对照组大鼠(2/7)出现肺转移,第19周,IL-2干预组、IL-15干预组较对照组肺转移发生率为[50%(2/4),25%(1/4)vs100%(8/8)],肺转移发生率及累积程度有明显差异(P<0.05)。IL-2、IL-15改善肝癌大鼠模型生存及抑制肺转移。结论： IL-2和IL-15细胞因子蛋白表达影响早期肝细胞癌患者术后生存复发,可以作为早期肝癌术后预后的独立预测因子,IL-2预测效能优于IL-15。IL-2和IL-15具有相似功能,均能抑制肿瘤生长及肺转移,从而改善肝癌大鼠模型生存。第二部分IL-2和IL-15抑制肝细胞癌生长转移的相关调节机制目的：我们前面的研究发现IL-2、IL-15是预测复发及总体生存的独立预测因子。恶性肿瘤的Thl/Th2免疫平衡状态及其与肿瘤的生物学行为及预后的关系正日益受到了国内外广大学者的重视。IL-2和IL-15是Thl类细胞因子,能诱导、增强细胞免疫而杀伤肿瘤细胞。本研究拟动态分析DEN诱导的大鼠肝细胞癌模型建模过程中Thl/Th2免疫状态变化及外源性重组蛋白IL-2、IL-15对模型肿瘤微环境的影响和调节机制,为肿瘤治疗提供新理论和新靶点。方法：我们通过Procarta细胞因子荧光微珠检测试剂盒检测不同时间点大鼠模型标本血清和肝组织中相关细胞因子浓度,分析Th1、Th2及Th17类细胞因子的表达特征。后应用RT-PCR技术探寻T-bet、GATA-3、 FOXP3以及ROR-yt等与免疫相关转录因子mRNA表达水平。Western blot进一步明确癌旁组织相关蛋白表达趋势,探讨TGF-βp、OPN变化特征,评价IL-2、IL-15对肿瘤免疫微环境的影响。结果：应用Procarta细胞因子检测试剂盒检测各时间点(1,4,8,12,16,17,18,19周)血清及癌旁肝组织IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-17、IFN-γ和TGF-β浓度,发现在建模早期(≤8周),Th1型细胞活化,免疫状态向Th-1偏移,其后(>8周)Th1型细胞因子IL-12p40、IFN-γ、IL-2逐渐降低。而Th2型细胞因子IL-4、IL-10持续升高,伴随IL-17及炎症抑制因子TGF-β明显升高,使机体细胞免疫持续抑制。而IL-2、IL-15干预后可以逆转这种现象,Th1型细胞因子浓度升高,Th2型细胞因子浓度逐渐下降。另外炎症抑制因子TGF-β、IL-17浓度下调,在第19周,IL-2、IL-15干预两组较之盐水对照组有显著统计学差异(P<0.05),但两者未见明显差异(P>0.05)。提示IL-2、IL-15可以下调炎症抑制因子TGF-β改变肝细胞癌大鼠模型免疫状态而使微环境向Thl偏移,促进特异性免疫杀伤肿瘤细胞。进一步在转录水平上验证,成瘤过程中,发现Thl型转录调控因子T-bet△Ct先降低,后再升高,表明早期有炎症过程,而后表现为炎症抑制,而Treg以及Th2型相关转录因子FOXP3、GATA3△Ct持续降低,表现为微环境炎症抑制,微环境由Thl向Th2偏移。同时,Thl7细胞类型调控因子ROR-yt在12周前先有下降而后出现反转,微环境表现为炎症抑制状态,促进肿瘤发生。另外,OPN mRNA含量持续升高,进一步表明在成瘤过程中OPN起着促癌作用。IL-2、IL-15干预后,发现大鼠免疫微环境重新向Thl偏移,Treg减少,OPN mRNA含量也出现下降趋势。最后用Western blot检测TGF-p和OPN及相关蛋白变化,发现模型成瘤过程中TGF-β和OPN浓度逐渐升高,OPN下游的转移相关因子UPA/MMP-3/MMP-9早期均无明显变化趋势,进展期表达逐渐升高,促进肿瘤侵袭转移。P53/RYBP持续下调,BCL-2逐渐上升,机体表现为凋亡抑制,加速肿瘤发展。膜表面Wnt受体LRP6表达缓慢上调,激活Wnt通路,从而提升胞浆中β-catenin的浓度,进而激活原癌基因C-MYC磷酸化而促进。IL-2及IL-15干预后均反转而表现为TGF-p、OPN UPA、MMP-3和MMP-9的表达下调,抑制Wnt通路活化,减少效应靶基因C-myc磷酸化,从而调控OPN的表达改善DEN诱导肝癌模型生存。同时IL-2能上调P53/RYBP表达,下调BCL-2,促进凋亡。结论：DEN诱导大鼠肝细胞模型成瘤过程中微环境向Th2偏移,同时Treg和Th17细胞增多,炎症抑制,Wnt通路激活,上调癌基因C-MYC表达,继而正向调控OPN,促进肿瘤发生发展。外源性IL-2和IL-15能下调TGF-β促使微环境Th1/Th2平衡向Thl偏移,同时减少Treg细胞和Th17细胞的分化,解除炎症抑制。IL-2能通过P53/C-MYB/RYBP/BCL-2调控凋亡。IL-2和IL-15还可经下调TGF-β途径来调控OPN表达,通过下调LRP6以及P-catenin来抑制Wnt通路,从而下调靶基因C-MYC激活继而抑制OPN表达,下调GATA-3改造微环境抑制肿瘤进展。创新点1.我们首次应用外源性重组IL-2和IL-15蛋白干预DEN诱导的大鼠肝细胞癌模型进行体内试验,发现IL-2和IL-15能下调TGF-p及下调LRP6、β-catenin抑制Wnt通路活化促使Th1/Th2平衡向Th1偏移,同时减少Treg细胞和Th17细胞,解除炎症抑制,最终改善生存。2.体内试验首次发现外源性IL-2和IL-15可下调TGF-p来调控OPN表达；还可抑制Wnt通路,从而下调靶基因C-MYC激活继而抑制OPN表达,IL2能通过P53/C-MYB/RYBP/BCL2调控凋亡。最终调节肿瘤侵袭转移能力改善模型生存。3.本研究同时从癌旁微环境和肿瘤自身着手,探寻免疫微环境和肿瘤之间的互动机制,寻找肿瘤新的干预手段。潜在应有价值1.癌旁IL-2和IL-15水平能够有效预测早期肝癌患者的生存和复发,有助于我们界定和选择高复发风险人群采取个体化治疗。2.免疫治疗调控微环境同时还可以调变肿瘤细胞侵袭特性。TGF.β/β-catenin/C-MYC/BCL-2/OPN可以作为潜在抗肿瘤作用靶点,为临床上控制肿瘤复发,提高肝癌的远期疗效提供新的思路。