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研究背景:肺癌目前是我国乃至全球发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生活质量和生命健康。我国第三次人口死亡原因的抽样调查中发现与过去30年的肺癌死亡率相比已经上升了465%。另外还有最新数据显示我国的肺癌发病率高达35.23/100000,死亡率高达27.93/100000,已经是我国死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌主要是由小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC）组成,而NSCLC占80%的比重。尤其值得注意的是约70%的确诊肺癌患者均为局部晚期或已经发生远端的转移,因此化疗在目前的临床治疗中就显得非常重要,在延长患者的生存时间,提高其生活质量方面具有重要的意义。多西他赛（docetaxel,DTX）作为第三代化疗新药,是治疗非小细胞肺癌重要的一线和二线药物,是作用于微管的抗肿瘤药物,具有显著的抗肿瘤作用,在临床上广泛用于乳腺癌、NSCLC、卵巢癌等的治疗。它能够促进细胞微管蛋白聚合并抑制微管解聚,导致微管动力学调节异常,激活纺锤体组装检验点,阻断细胞正常有丝分裂,使细胞周期阻滞于G2/M期,进而引起细胞凋亡。但是,多西他赛易耐药在很大程度上影响了其治疗。至今为止已经发现多个Cullin-RING E3泛素连接酶复合物的支架蛋白,而Cullin7（Cul7）便是其重要成员之一。研究显示,Cul7与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,研究报道3-M综合征相关互不相交的突变基因（Cul7、OBSL1、CCDC8）以及FBXW8能形成3M复合体,3M复合体通路以及下游分子Cul9对保持细胞微管和基因组完整性具有重要的作用。Cul7的异常表达可以导致微管动力学紊乱,组织有丝分裂和胞质分裂。敲低Cul7能够增强肺癌细胞对非毒性剂量紫杉醇的敏感性。我们和其他研究人员发现,Cul7在NSCLC组织中高表达,能够促进NSCLC细胞增殖,侵润和转移。在NSCLC的多西他赛耐药细胞株中我们已经观察到了Cul7高表达。但是目前还没有关于Cul7与肿瘤耐药相关的报道,其耐药机制也尚不清楚。目的:本课题拟研究Cul7在NSCLC多西他赛耐药中的作用。在亲本细胞中敲低和过表达Cul7后检测其对多西他赛药物敏感性的变化,鉴定Cul7与多西他赛耐药的相关性以及其可能的分子机制,为阐明NSCLC耐药分子机制提供新的线索,也将为临床肿瘤多西他赛耐药的干预策略提供新的思路。方法:1.应用MTS的方法检测计算实验室NSCLC细胞及其由美国密歇根大学Max Wicha教授实验室提供的相对应的多西他赛耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)和耐药倍数。2.运用Real-time PCR、Western Blot免疫印迹和免疫荧光的方法检测Cul7在NSCLC亲本和耐药细胞中的表达以及定位情况。3.使用流式细胞术检测相同多西他赛加药浓度下NSCLC亲本和耐药细胞凋亡情况和周期变化的不同。在NSCLC亲本细胞中逐渐增加依托泊苷和多西他赛的加药浓度,并用Western Blot免疫印迹检测Cul7蛋白的表达变化。4.质粒介导构建Cul7sh RNA干扰A549、H358、H1299、A549DTX和H358DTX细胞中Cul7的表达。使用真核细胞载体p CDNA3-HA-Cul7,采用脂质体Lipofectamine2000转染A549和H1299细胞,过表达Cul7。运用Real-time PCR、Western Blot免疫印迹技术检测其干扰以及过表达的效率。5.应用MTS的方法检测干扰和过表达Cul7的细胞A549和H1299对多西他赛和依托泊苷药物敏感性的变化。6.通过Western Blot免疫印迹检测A549、A549DTX、A549shNeg、A549sh Cul7、A549p CDNA3和A549HACul7等细胞中Cul7和Survivin的表达变化。通过运用免疫组化技术来验证非小细胞肺癌组织中Cul7和Survivin的表达。7.使用Si RNA瞬时敲低H1299DTX和H1299HACul7细胞中Survivin,并通过Real-time PCR和Western Blot免疫印迹的方法检测干扰效率。用MTS的方法检测转染后H1299DTX和H1299HACul7细胞对多西他赛药物的敏感性。结果:本研究中使用MTS方法检测NSCLC亲本细胞A549、H358及其对应的多西他赛耐药A549DTX、H358DTX的IC50,得到其稳定耐药倍数分别约为18倍和11倍。与亲本细胞相比,在耐药细胞中,Cul7在蛋白和m RNA水平均呈现高表达,免疫荧光显示其在胞核和胞浆均有表达,但在胞核中高表达。流式细胞术结果显示相同多西他赛加药浓度下,耐药细胞凋亡明显少于亲本细胞（P<0.05）。敲低或过表达A549、H1299细胞中的Cul7,肿瘤细胞对多西他赛、紫杉醇和依托泊苷的药物敏感性分别呈现增强或降低的趋势（P<0.05）。在A549DTX、H358DTX中敲低Cul7后,细胞对多西他赛的敏感性明显增强（P<0.05）。Western Blot免疫印迹检测发现在NSCLC多西他赛耐药细胞中Cul7和Survivin均有高表达,在亲本细胞中敲低或过表达Cul7,Survivin也会随之下调或上调。在H1299DTX和H1299HACul7细胞中瞬时沉默Survivin,发现肿瘤细胞对多西他赛的敏感性增强（P<0.05）。在本研究中,我们还发现敲低Cul7的A549DTX细胞中Caspase3没有明显的变化,Cleaved-Caspase3发生明显的上调,而在敲低Cul7的H358DTX细胞中可以看出Cleaved-Caspase3也有一定程度地上调,但是不太明显。结论:Cul7在多西他赛耐药的NSCLC细胞中高表达,参与NSCLC多西他赛耐药的形成。而这一耐药机制可能是Cul7通过上调了下游的Survivin蛋白,抑制细胞凋亡来实现的。