从世界完成首例造血干细胞移植到现在已经有50年的时间了，这项技术已经成为治疗各类恶性血液病的最为有效的方法，每年全球移植病例数都在增加，接受这项技术治疗的患者最长的无病生存时间已经超过35年了。造血干细胞的成功植入是HSCT发挥治疗作用的前提，在临床治疗中于宿主HLA不全相合、输注造血干细胞数量不足、移植前大剂量化疗致骨髓基质损伤严重及移植物抗宿主病发生均会导致造血干细胞植入失败或植入延迟，从而使移植死亡率增加，使得该技术在实际应用中面临着很大困难。特别是在一些恶性血液病的治疗中，由于长期、多次的输入异体来源的HSC，极易引发致死性的肺损伤以及移植后感染。因此，解决HSCT中的HSC的来源以及其安全问题，获得稳定、高效的造血干细胞或具有造血潜能的细胞成为进一步推广HSCT的关键，这不仅具有重要的医学意义，而且将产生巨大的社会经济效益。以往的观点认为，未分化细胞分化形成特定类型的终末细胞这一过程是不可逆的；但近几年发育生物和干细胞技术的发展可以成功的将一种类型的组织特异性细胞转化形成另外一种类型的细胞。在HSCT的病人中也支持了这些观点。HSCT数月后，可以在病人的骨髓或者造血组织中发现来源于宿主的表皮细胞、肝细胞，甚至还出现了消化管上皮细胞等。这些结果表明在体内环境中的人体干细胞在分化过程中存在着一定的不确定性。而现在的表观遗传学研究也为终末细胞之间的互相转化提供了可能。也有实验表明可以讲表皮细胞或者其他细胞诱导成为造血系细胞。如果这些研究成果能够成熟并且得以应用，将解决上面提到的HSCT中出现的问题。间充质细胞是容易得到的较为幼稚的一类干细胞，而且具有多向分化潜能，可以在体外容易大量增殖，如果可以将间充质细胞成功诱导形成造血细胞，探明转化的机制，将具有广阔的应用前景。本课题拟以人脐带间充质干细胞为诱导前体细胞，采用贴壁法和酶消化法获得原代细胞，纯化后再分选出较为均一的有多系分化潜能的多能干细胞群，经过化学诱导的方法，改变其表观遗传学表达，对诱导后细胞进行形态、免疫学和造血功能等方面的检测，探讨其向造血细胞方向分化的可行性。进一步研究细胞分化过程中MiRNA的表达变化，分析诱导后细胞内表观遗传学变化的方式和方法。与成体来源，如骨髓间充质干细胞相比，hUMSCs的幼稚程度更低，HLA抗原表达更弱，其扩增和多向分化能力也较强；与HSC相比，两者都属于来源于胚外中胚层的间充质组织，所以从理论上具有转化的可能。以往在HSCT中MSC一直作为辅助使用细胞，但是如果能够稳定的将MSC诱导形成HSC，将解决HSCT中存在的来源不稳定和异体移植的问题，在临床上发挥不可估量的作用。第一部分：人UMSCs的分离培养与鉴定方法：（1）分别采用贴块法和酶消化法获得原代培养的hUMSCs，传代纯化后进行克隆化培养，培育出形态和增殖能力较为单一的细胞克隆。（2）光镜及电镜观察hUMSCs克隆化后的形态学特点。（3）取第4代（P4）的hUMSCs进行免疫细胞荧光化学染色和流式细胞仪检测间充质干细胞的标志性分子：Vimentin、α-SMA、Oct-4、Sox-2、HLA-1、CD29、CD34、CD133、CD44和CD45。（4）取P4hUMSCs进行流式细胞仪检测细胞周期DNA含量。（5）对克隆化hUMSCs进行体外细胞诱导分化，鉴定其脂肪与成骨细胞方向分化的潜能。结果：原代培养7d后可见培养瓶中有克隆样生长的细胞团，经过单一细胞的克隆化传代培养后：（1）形态上呈梭形或纺锤形，胞浆丰富；透射电镜显示，克隆化P4hUMSCs细胞核内异染色质较少，核仁明显。（2）表面标志分子上，免疫荧光细胞化学检测显示，P4hUMSCs均表达间质细胞骨架蛋白Vimentin、早期平滑肌细胞表面标志物α-SMA、全能性转录因子Oct4和Sox2、间充质干细胞表面抗原CD29和CD44、其中23%的细胞表达CD133、5%细胞表达HLA-1、）。5%的细胞表达CD34和CD44。（3）细胞周期分析上，hUMSCs85％以上细胞是处于静止期，即G0/G1期，S+G2+M的细胞平均约占13%，符合干细胞细胞周期的特点。（4）单个细胞来源的P4hUMSCs在体外具有向骨细胞和脂肪细胞等终末细胞分化的潜能。结论：（1）我们所获得的hUMSCs具备了间充质干细胞的大部分标记，而且CD133阳性率较高表明其中相对幼稚细胞数量较多，HLA-1阳性率较低表明源于脐带组织的干细胞其免疫标记较弱，更适用于干细胞移植过程。（2）hUMSCs可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，表明其具有多向分化的潜能。第二部分：化学诱导hUMSCs向造血细胞方向分化方法：（1） hUMSCs向造血细胞方向体外分化诱导模型的建立：设立5-Aza与造血生长因子GF共同诱导为实验组，GF诱导和为诱导组为对照组。实验用基本培养基为甲基纤维素化培养基，诱导浓度设定在2.5μg/ml5-Aza，50ng/ml GM-CSF和SCF，设定诱导后1d、3d、5d、7d和10d的不同观测时间，尽可能提高CD34的阳性细胞比例。（2）对诱导后细胞进行表面标记的检测：显微镜观察诱导后细胞形态以及超微形态结构的改变；流式细胞仪检测表面标记分子，包括CD34、CD45、CD133、CD11b、CD44和CD29；免疫荧光检测细胞形态改变时细胞表达Hoxb4与Vimintin的情况；PCR反应检测细胞内造血相关信号分子Hoxb4、Scl-1、Wnt3a和Gata2。（3）对诱导后细胞进行造血功能的检测：利用经典脾集落实验，将诱导后的hUMSCs注射进入接收致死剂量照射的裸鼠体内，15d后检测裸鼠的血常规、脾脏切片。结果：（1）随着诱导时间延长，5-Aza/GF联合诱导组中细胞悬浮于培养基中，呈现出集落样生长的形态。透射电镜观察，细胞内细胞器数量减少，细胞形态核质比进一步增大，核内染色质分布与造血细胞类似。（2）细胞表面标记检测：CD34、CD45和CD133细胞阳性比例随着诱导时间延长而逐渐升高，CD29和CD44却逐渐下降。对诱导5d后的细胞铺片进行免疫荧光检测，其中部分形态变圆的细胞核内已经高表达Hoxb4，而仍为梭形的细胞其胞质内仍表达Vimintin；同时，PCR检测造血信号表达可见Hoxb4、Scl-1、Wnt3a和Gata2的表达均随着诱导天数的增加而增加。（3）造血功能检测：脾集落实验后，采集小鼠外周血，血常规分析接种5-Aza/GF联合诱导细胞组中的粒细胞升高较为明显，有统计学意义；通过对小鼠脾脏切片染色分析，可见组织中有大量细胞表达HLA-1。结论：经过5-Aza/GF联合诱导后的hUMSCs，在形态上已经不具备了间充质细胞的形态特点，逐渐与成体HSC类似，在表面分子标记上，已经有很大一部分比例细胞开始表达造血干细胞的特异性分子CD34与CD45，而且更为原始的细胞标记CD133也有所上升，细胞形态发生改变后，参与造血过程的胞内重要信号分子Hoxb4表达大大增多，而且通过脾集落实验也可以证明诱导后的hUMSCs在体内具备了造血重建的功能。可见，在5-Aza/GF联合诱导作用下，hUMSCs可以朝向造血细胞方向分化，具备了造血细胞形态特征和功能特点。第三部分： hUMSCs向造血细胞方向分化过程中相关MiRNA的变化方法：（1）根据MiRNA文库预测以及相关文献报道，挑选了miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218为主要研究对象，利用primer6.0生物学软件设计以上5条RNA的逆转录和RealtimePCR引物。（2）收集5-Aza/GF联合诱导3d、7d和10d的hUMSCs，以单独GF诱导为实验对照，以HSC和hUMSCs为阳性和阴性对照，RNA抽提试剂Trizol裂解收集的细胞抽提RNA。MMLV逆转录酶的作用下行逆转录反应，syberGREEN系统的realtimePCR反应，检测不同时间点相关MiRNA的差异。（3）挑选表达差异较大的MiRNA，体外合成相关MiRNA片段，脂质体将其转染进入培养的hUMSCs中，24h后Realtime PCR检测其表达量的变化，利用甲基纤维素化培养基培养细胞，1w后收集转染细胞，Westernblot检测造血相关因子Hoxb4的表达，验证该MiRNA在造血分化过程中的作用。结果：（1）RealtimePCR反应检测miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218等MiRNA，在诱导后的hUMSCs内表达均有所增加，而且随时间增加表达量进一步增加，其中以miR-218和miR-451增加较为显著。（2）选取miR-218验证其下游功能，将miR-218转染进入hUMSCs细胞内，24h后细胞内miR-218表达升高，证明转染有效。1w后细胞内造血相关因子HoxB4的表达量进一步升高。结论：hUMSCs向造血细胞方向分化过程中miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218表达量均增高，其中miR-218对造血功能启动具有一定意义。研究结论和意义1．应用化学诱导的手段进行重编程以获得专能干细胞。应用化学诱导的方法，设定多个浓度和参考条件，为获得稳定的造血细胞提供了更加可能的条件。2．从表观遗传学角度探明间充质类细胞向造血细胞方向的机制。由于采用了改变细胞表观遗传学的方法诱导，所以可直接关注到MiRNA的变化，为研究细胞转化过程的决定因素的探讨提供了理论依据。3为临床中HSCT提供了一种新理念。研究中试图用改变表观遗传表达对较为原始的间充质细胞加以改造，为HSCT提供了新的方法。