【摘 要】
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研究背景及目的:三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）患者不能从内分泌治疗和靶向治疗中获益,与其他乳腺癌亚型相比,TNBC患者的复发率更高,预后更差。因此,寻找新的治疗靶点至关重要。随着癌症研究的进展,肿瘤微环境（tumor microenvironme nt,TME）的重要作用引起了广泛关注。其中,肿瘤相关性巨噬细胞（tumor-associated
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研究背景及目的:三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）患者不能从内分泌治疗和靶向治疗中获益,与其他乳腺癌亚型相比,TNBC患者的复发率更高,预后更差。因此,寻找新的治疗靶点至关重要。随着癌症研究的进展,肿瘤微环境（tumor microenvironme nt,TME）的重要作用引起了广泛关注。其中,肿瘤相关性巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是乳腺癌微环境中浸润程度最高的免疫细胞之一,并且TAMs密度与TNBC患者的生存预后密切相关。然而,TAMs在TNBC中的作用及其促癌机制并未被完全阐明。本研究以TNBC小鼠模型为基础,探索TAMs促进TNBC增殖的潜在机制和以TAMs为靶点的治疗策略。研究方法:1、于雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫注射4T1细胞建立TNBC模型,流式细胞术检测TAMs表型。提取BALB/c小鼠骨髓细胞在体外分化诱导成为与TAMs表型相同的巨噬细胞。2、细胞增殖实验检测TAMs上清液或TAMs共培养条件下,4T1细胞的增殖能力。将4T1细胞与TAMs混合注射于小鼠乳腺脂肪垫,观察外源性TAMs对肿瘤体积和重量的影响。3、建立TAMs与4T1细胞的共培养系统,对4T1细胞进行高通量测序,寻找发生显著改变的信号通路。RT-PCR检测4T1细胞与TAMs的共培养环境中与目标通路相关的生长因子（EGF,HB-EGF,TGF-α,TGF-β3,PDGFB,IGF-1）基因表达量。根据测序结果选择目标通路的抑制剂干预4T1细胞,免疫印迹实验和流式细胞技术检测药物的抑制效应,细胞增殖实验检测药物对4T1细胞增殖能力的影响。4、局部注射氯磷酸盐脂质体清除TAMs,动物实验观察其对肿瘤体积和重量的影响;免疫荧光染色检测肿瘤组织内CD206+TAMs以及促增殖通路蛋白的表达量。5、清除TAMs联合目标通路抑制剂干预TNBC小鼠模型,动物实验观察肿瘤体积和重量变化。流式细胞术检测肿瘤组织内TAMs、CD4+/CD8+T淋巴细胞比例,免疫荧光检测目标通路的活化程度。实验结果:1、TNBC小鼠模型中TAMs表型以:CD11b+F4/80+CD206+为主。提取BALB/c小鼠骨髓细胞给予细胞因子M-CSF和IL-4干预,获得与TAMs表型相同的巨噬细胞,流式细胞术验证其纯度>98%。2、TAMs上清液或TAMs共培养条件均能够显著促进4T1细胞增殖。动物实验显示:与对照组肿瘤相比,注射外源性TAMs显著增加肿瘤的体积及重量。3、对TAMs共培养处理后的4T1细胞进行高通量测序分析发现:4T1细胞的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路发生显著改变,免疫印迹实验和流式细胞检测均证实MAPK通路明显激活。共培养环境中4T1细胞和TAMs产生的MAPK通路上游生长因子（EGF,HB-EGF,TGF-α,TGF-β3,PDGF-B,IGF-1）基因表达量显著升高。MAPK通路抑制剂司美替尼（Selumetinib）能够有效抑制TAMs介导的促4T1细胞增殖作用。4、局部注射氯磷酸盐脂质体清除TAMs能够显著抑制肿瘤生长,增加肿瘤浸润性CD4+/CD8+T淋巴细胞比例。肿瘤切片免疫荧光检查提示:清除TAMs抑制MAPK通路激活。生物信息学分析发现:在乳腺癌标本中,代表TAMs和MAPK通路的关键基因的表达量呈正相关。5、与单一治疗方案相比,清除TAMs联合司美替尼治疗能够更加有效抑制肿瘤生长和MAPK通路激活。结论:1、TNBC小鼠模型中TAMs主要为M2型巨噬细胞,TAMs能够显著促进TNBC增殖。2、TAMs通过MAPK通路促进4T1细胞增殖,使用司美替尼靶向抑制MAPK通路能够有效抑制TAMs介导的促增殖作用。3、清除TAMs能够显著增加肿瘤浸润性CD4+/CD8+T淋巴细胞比例,抑制MAPK通路激活。3、与单一治疗方案相比,清除TAMs联合MAPK通路抑制剂能够获得更好疗效。
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