背景和目的:子痫前期(pre-eclampsia,PE)是一个病因未明的复杂疾病,以母体高血压、蛋白尿等为特征,约占妊娠妇女的5%-8%[1]。病情严重时,将导致母亲子痫抽搐的发生以及胎儿宫内死亡。唯一确切的治疗方式就是胎儿及其附属物娩出,但却增加了新生儿早产的发生率[2]。子痫前期治疗效果不佳的症结主要是其病因不明,目前的病因学研究主要集中在滋养细胞功能异常及早期胎盘形成不良。胎盘形成和胚胎植入是早期妊娠必经的过程,是妊娠延续中最重要的决定因素之一。滋养细胞的侵袭为胎盘形成奠定基础,其侵袭程度决定了胎盘的稳定性和胎盘与蜕膜结合的深度。同时,滋养细胞锚定子宫螺旋动脉确保了胎儿有足够的氧和营养物质供应,当滋养细胞侵袭不足、局部功能障碍,将导致许多严重的产科并发症发生,如流产、子痫前期、胎盘早剥、死胎等。而滋养细胞侵袭过度将导致滋养细胞疾病的发生,如侵袭性葡萄胎、绒毛膜癌等,对母体的生命造成伤害。因此,只有胚胎侵袭入母体与母体在这一过程中的自救相互平衡,胚胎才能得以顺利孕育。早期胚胎中染色体核型异常时,大多数(90%)都被自然淘汰而流产了,而染色体核型正常的早期胚胎,大多数(93%)都继续妊娠,显著地体现了胚胎与母体之间的这一平衡[3]。因此,流产是滋养细胞侵袭失败的结局,是自然质量控制的结果。所有影响滋养细胞侵袭和锚定在子宫螺旋动脉的因素,势必决定着胚胎孕育的成败。滋养细胞的侵袭受到胞内和胞外许多信号通路的精细调节,涉及识别并消化细胞外基质、定向迁移等多个过程,其中,滋养细胞的定向迁移是侵袭行为的关键步骤。与绝大多数细胞迁移模式相同,滋养细胞的定向迁移包括细胞极化、伪足形成、基质粘连、尾部释放、胞体收缩等多个环节,而细胞骨架和粘连结构的动态重组是一个基础环节,也是各种因素调控滋养细胞迁移的重要靶点[4,5]。细胞骨架主要由微管和微丝组成,我们课题组前期研究发现,表皮生长因子(EGF)通过微丝结构重组刺激人滋养细胞迁移,而关于微管与滋养细胞迁移之间关系的研究较少。微管是具有极性的中空管状结构,在细胞内的分布呈束网状,并构成一个轨道运输系统,多种细胞物质如囊泡、细胞器等均顺着其极性方向移动,并且,微管还参与中心粒等的装配、细胞形态维持、细胞运动和分裂等过程[6,7]。微管骨架稳定聚合的调节依赖于一系列结合于微管内、外侧的微管结合蛋白(microtubule-associatedprotein,map),其中map4在人滋养细胞有表达,是促进滋养细胞微管稳定延长的正性调节因素。微管在胞内的稳定聚合、延长方向可以精确地指向细胞与胞外基质粘连的粘着斑部位,微管向粘着斑移动与细胞周围的粘着斑溶解有关。对于迁移的细胞,依赖微管的粘着斑溶解对于分解细胞后方粘着斑十分重要[8]。jeg-3细胞来源于人绒毛膜癌组织,其形态、生化标志、功能等细胞特征与绒毛组织原代培养的滋养细胞最为相似。因此,本实验用jeg-3细胞研究人滋养细胞的迁移和可能机制。实验方法:第一部分:缺氧通过map4对滋养细胞迁移的调控及机制的研究1.常氧和低氧培养滋养细胞,根据缺氧时间将细胞分为五组0h、6h、12h、18h、24h组;2.transwell法分析滋养细胞侵袭性迁移能力;3.免疫荧光染色分析滋养细胞内微管、黏着斑结构变化;4.western-blot法检测蛋白表达的变化;5.使用excel及spss软件整理数据。第二部分:map4、细胞骨架蛋白在子痫前期患者胎盘组织中的表达1.搜集选取第三军医大学第三附属医院(大坪医院)产科2013年01月—2014年03月收治的重度子痫前期患者(pe组)20例和正常晚孕患者(control组)20例行择期剖宫产后的胎盘组织;2.通过组织he染色研究实验组和对照组胎盘组织中绒毛和血管的差异;3.通过组织免疫组化研究胎盘绒毛组织中相关分子的定位及表达;4.提取胎盘绒毛相关蛋白,行western-blot分析其表达量。结果:1.低氧抑制滋养细胞侵袭,6h组与0h组比较,侵袭能力明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);随着缺氧时间的延长,滋养细胞侵袭能力进一步降低,12h组与0h组、6h组比较,18h组与12h组比较,差异均有统计学意义(p<0.05);2.随着缺氧时间延长,map4、微管蛋白表达逐渐降低,微管逐渐解聚、黏着斑逐渐聚合,黏着斑蛋白表达逐渐增多;3.与正常对照组相比,pe组胎盘组织血管痉挛、闭塞、血流量减少;4.与正常对照组相比,PE组胎盘组织中微管蛋白和MAP4蛋白表达较少、黏着斑蛋白表达较多,与滋养细胞低氧环境中表达一致。结论:1.低氧环境中,MAP4的变化可能通过影响细胞骨架中微管的聚合和黏着斑的形态调控滋养细胞迁移;2.PE患者胎盘组织血管痉挛、闭塞、血流量减少,绒毛发育不良,可能与局部血管病变有关,为临床胎盘缺血缺氧提供了直接证据。同时,PE患者胎盘组织中MAP4、α-tubulin、vinculin蛋白表达异常,可能为胎盘局部缺血奠定基础,为子痫前期的病因学研究提供佐证。