自然流产(SA)是指怀孕至20周以前发生的流产,是妇产科常见的生殖障碍疾病。近年来随着自然流产的发生率增加,学术界对自然流产机制研究仍然是一个热门的话题,但自然流产的发生机制却尚未明确,很多已有研究提出滋养细胞侵袭功能不足易引发自然流产,滋养细胞维持正常的迁移和侵袭功能是保证正常妊娠的重要因素。因此滋养细胞则成了研究自然流产病理机制常用的工具,而划痕试验和Transwell试验分别作为检测滋养细胞迁移和侵袭功能常用的实验室检测方法。miRNA存在人体内的微小RNA,在多种疾病中存在着不同的作用。经过对比自然流产患者和正常早孕者的绒毛组织发现miRNA-126-3p的表达差异,提示miRNA-126-3p可能与自然流产的发生有关系。而菟丝子总黄酮作为补肾安胎的代表药物,其对滋养细胞侵袭功能的调控作用尚未见报导,因此深入研究菟丝子总黄酮的对滋养细胞影响的药效机制具有重要意义,菟丝子总黄酮是否会通过调控miRNA-126-3p来促进滋养细胞的侵袭功能是本课题即将探讨的问题。目的:研究自然流产患者绒毛组织与正常早孕者绒毛组织内miRNA-126-3p表达差异,探讨miRNA-126-3p对滋养细胞迁移和侵袭功能的影响;构建自然流产状态滋养细胞模型,探讨菟丝子总黄酮对正常滋养细胞和自然流产状态细胞模型滋养细胞的调控机制研究。方法:1.miRNA-126-3p的验证及其功能研究:通过RT-qPCR方法验证自然流产患者和正常早孕者绒毛组织中miRNA-126-3p的表达差异,利用Lipofectamine(?)2000作为载体将miRNA-126-3p过表达与抑制型序列转染至滋养细胞,划痕试验和Transwell试验观察滋养细胞的迁移和侵袭能力,并用RT-qPCR方法检测滋养细胞内miRNA-126-3p的表达变化。2.菟丝子总黄酮对正常滋养细胞侵袭和迁移功能的影响:采用UV和HPLC方法测定菟丝子总黄酮的含量,用MTT法检测菟丝子总黄酮对滋养细胞的毒性。划痕试验和Transwell试验检测菟丝子总黄酮对正常滋养细胞侵袭和迁移功能影响。3.菟丝子总黄酮对米非司酮所致EVT细胞自然流产状态细胞模型的迁移和侵袭功能影响:采用检测不同浓度米非司酮对滋养细胞的迁移功能影响,再进一步用米非司酮处理已转染miRNA-126-3p的滋养细胞,构建自然流产状态滋养细胞模型,同时用划痕试验检测其迁移功能的变化,RT-qPCR方法检测该细胞内miRNA-126-3p的变化。用菟丝子总黄酮处理自然流产状态细胞模型,划痕试验和Transwell试验检测不同组的迁移和侵袭功能,以及用RT-qPCR方法检测细胞内miRNA-126-3p的表达变化。4.菟丝子总黄酮对米非司酮所致EVT细胞内自然流产状态细胞模型的迁移和侵袭功能的内在机制研究:采用miRanda,miRDB,TargetScan,CLIP四个数据库预测miRNA-126-3p的靶基因,采用GO富集分析和KEGG通路分析预测miRNA-126-3p的靶基因、可能的细胞功能和参与的信号通路,并用RT-qPCR和WB的验证可能作用的靶基因变化。最后用双荧光素酶报告基因和绒毛组织验证确定miRNA-126-3p与靶基因的调控关系。5.菟丝子总黄酮通过影响滋养细胞内MMP9调控其迁移和侵袭功能:通过用RT-qPCR检测经菟丝子总黄酮处理后滋养细胞EVT内MMP9 mRNA表达,采用western blotting方法检测菟丝子总黄酮不同浓度与不同给药时间对EVT细胞内MMP9与相关信号通路的表达调控。结果:一、miRNA-126-3p的验证及其功能研究1.自然流产患者绒毛组织中miRNA-126-3p的表达比正常早孕者绒毛组织上调,两组间有统计学差异(p<0.05)。2.成功转染miRNA-126-3p至滋养细胞,构建miRNA-126-3p过表达和干扰模型,与正常滋养细胞相比,miRNA-126-3p mimic组的miRNA-126-3p表达明显上调(p<0.001),miRNA-126-3p inhibitor 组的 miRNA-126-3p 表达明显下调(p<0.01)。3.过表达miRNA-126-3p后,滋养细胞的迁移和侵袭能力降低,侵袭细胞数目明显降低(p<0.05);而干扰miRNA-126-3p后,滋养细胞的迁移和侵袭能力提高,侵袭的细胞数目明显增加(p<0.01)。二、菟丝子总黄酮对正常滋养细胞侵袭和迁移功能的影响1.UV法测得菟丝子总黄酮的总黄酮含量达90.876%,再用HPLC方法检测得菟丝子总黄酮内单体含量包括含芦丁77.75%,槲皮素占0.41%,及其极少量的异鼠李素0.03%,其总黄铜的含量总达78.19%。2.不同浓度的菟丝子总黄酮对滋养细胞无明显毒性。3.1 μ g/ml和5 μ g/ml的菟丝子总黄酮能明显促进滋养细胞的迁移功能,呈时间和剂量依赖性;1 μg/ml和5μg/ml的菟丝子总黄酮能提高滋养细胞的侵袭能力,细胞侵袭数目与DMSO组相比有统计学差异(p<0.05)。三、菟丝子总黄酮对米非司酮所致EVT细胞自然流产状态细胞模型的迁移和侵袭功能影响1.30 μ mol/L和60 μmol/L的米非司酮明显抑制滋养细胞的迁移和侵袭能力,同时上调滋养细胞内源性miRNA-126-3p的表达。2.30 μmol/L米非司酮干预转染miRNA-126-3p后的滋养细胞,成功对米非司酮干预miRNA-126-3p mimic-MIF组构建自然流产状态下滋养细胞模型,该模型组对比米非司酮干预miRNA-126-3p inhibitor-MIF组迁移能力降低,且miRNA-126-3p表达更高。3.以 miRNA-126-3p mimic negative-DMS0 组为对照,miRNA-126-3pmimic-DMSO迁移能力降低,用菟丝子总黄酮干预后,miRNA-126-3p mimic negative-TSZ组较其DMSO组细胞迁移能力增加,同样地miRNA-126-3p mimic-TSZ组较其DMSO组细胞迁移能力增加,说明用菟丝子总黄酮干预后,对比DMSO,能提高正常或过表达miRNA-126-3p滋养细胞的迁移能力。4.以 miRNA-126-3p inhibitor negative-DMSO 组为对照组,miRNA-126-3p inhibitor-DMSO迁移能力增加,用菟丝子总黄酮干预后,miRNA-126-3p inhibitor negative-TSZ组较其DMSO组细胞迁移能力增加,同样地miRNA-126-3p inhibitor-TSZ组较其DMSO组细胞迁移能力也增加,而且miRNA-126-3p inhibitor-TSZ组的细胞迁移能力高于miRNA-126-3p inhibitor negative-TSZ组,说明在菟丝子总黄酮作用下,对比DMSO,能明显增加干扰miRNA-126-3p后的滋养细胞的迁移能力。5.miRNA-126-3p inhibitor-TSZ 组的细胞迁移能力高于 miRNA-126-3p mimic-TSZ组,从而说明了菟丝子总黄酮能提高滋养细胞的迁移能力,而且也能提高自然流产状态的滋养细胞的迁移功能,如果干扰滋养细胞内miRNA-126-3p的表达,使其下调,此时菟丝子总黄酮提高滋养细胞迁移能力作用更明显。6.菟丝子总黄酮促进米非司酮诱导EVT细胞内自然流产状态细胞模型的侵袭功能。miRNA-126-3pmimic-TSZ组较其DMSO组细胞侵袭能力增加,对比miRNA-126-3p mimic negative-DMSO 组有统计学差异(p<0.05)。miRNA-126-3p inhibitor-TSZ组也较其DMSO组细胞侵袭能力增加,对比miRNA-126-3p inhibitor negative-DMSO组有统计学差异(p<0.05)。而miRNA-126-3p inhibitor-TSZ组的细胞侵袭能力高于 miRNA-126-3p mimic-TSZ 组(p<0.001)。7.以 miRNA-126-3p mimic negative-DMSO 组为对照组,miRNA-126-3p mimic-DMSO组和-TSZ组的miRNA-126-3p表达上调,有统计学差异(p<0.05);以miRNA-126-3p inhibitor negative-DMSO 组为对照组,miRNA-126-3p inhibitor-TSZ组的miRNA-126-3p的表达明显下调,对比有统计学差异(p<0.05)。造模组的miRNA-126-3p mimic-TSZ 组和 miRNA-126-3p inhibitor-TSZ 组两两比较,miRNA-126-3p inhibitor-TSZ 组的 miRNA-126-3p 水平明显降低(p=0.05)。四、菟丝子总黄酮对米非司酮所致EVT细胞内自然流产状态细胞模型的迁移和侵袭功能的内在机制研究1.通过数据库筛选出miRNA-126-3p的靶基因,并从中挑选出关于细胞迁移和侵袭功能的靶基因有10个,主要包括VEGFA,SDC2,GOLPH3,SLC7A5,PEX5,ITGA6,NAV1,SMURF2,PLXNB2,PPP3CB,关于细胞血管生成功能的有CRK,PIK3R2靶基因。2.通过RT-qPCR方法检测SLC7A5,NAV1,PLXNB2,PEX5四个靶基因的mRNA的水平在miRNA-126-3p mimic组表达下调,而miRNA-126-3p inhibitor组表达上调。3.转染miRNA-126-3p至滋养细胞作用48h后,靶基因PLXNB2,对比miRNA-126-3p mimic negative组,mimic组的PLXNB2蛋白水平明显下调,两组间有统计学差异(p<0.01);以miRNA-126-3p mimic为对照组,inhibitor组和菟丝子总黄酮组的PLXNB2蛋白水平明显提高,具有统计学差异(p<0.01)。4.转染miRNA-126-3p至滋养细胞作用48h后,靶基因PEX5,对比miRNA-126-3p mimic negative组,mimic组的PEX5蛋白水平明显下降,两组间有统计学差异(p<0.05);以miRNA-126-3p mimic为对照组,inhibitor组PEX5蛋白水平明显提高,具有统计学差异(p<0.01),但菟丝子总黄酮组的PEX5蛋白水平未见明显升高。5.双荧光素酶报告基因结果提示,相对比野生型PLXNB2-WT+Non-target Control组,PLXNB2-WT+mimic组的荧光素蛋白的表达水平降低,两组具有显著性统计学差异(p<0.001);而突变型 PLXNB2-Mut+Non-target Control 组相对于PLXNB2-WT+Non-target Control组荧光素蛋白表达水平无明显差异,PLXNB2-Mut+mimic 组的荧光素蛋白的表达水平与 PLXNB2-Mut+Non-target Control组相比有少许降低,差异不显著。PLXNB2是miRNA-126-3p的靶基因。6.WB试验结果证明自然流产组织中PLXNB2蛋白水平相比正常妊娠组织水平表达下降,具有统计学差异(p<0.001)。五、菟丝子总黄酮通过影响滋养细胞内MMP9调控其迁移和侵袭功能1.经菟丝子总黄酮干预后,0.5 μ g/ml、1 μ g/ml和5 μ g/ml的菟丝子总黄酮组中MMP9的基因水平均显著升高(p<0.01),1 μ g/ml和5μg/ml的菟丝子总黄酮组MMP9的蛋白水平显著上调(p<0.01)。1 μ g/ml的菟丝子总黄酮治疗滋养细胞内的MMP9蛋白和mRNA水平表达升高(p<0.01),干预8h和12h后,MMP9蛋白和mRNA表达水平差异有统计学差异。2.对MAPK通路的影响,1 μ g/ml和5 μ g/ml的菟丝子总黄酮组对比与DMSO组,p-ERK升高最明显(p<0.01),而ERK总蛋白水平不受影响;在不同的作用时间,1 μ g/ml的菟丝子总黄酮作用于滋养细胞后,ERK的磷酸化水平在1h,2h和8h时呈现显著性改变。1 μ g/ml和5 μ g/ml菟丝子总黄酮能促进滋养细胞内p38的磷酸化水平升高(p<0.01),具有统计学差异,而p38总蛋白水平则无明显变化。3.对AKT通路的影响,1 μ g/ml和5 μ g/ml的菟丝子总黄酮作用于滋养细胞时,AKT(308)的磷酸化水平上调(p<0.05),其总蛋白AKT水平不影响;5 μ g/ml的菟丝子总黄酮能上调p-AKT(473)的蛋白表达水平(p<0.05),而不影响其总蛋白的变化;1 μg/ml的菟丝子总黄酮不同的作用时间,p-AKT(308)和p-AKT(473)在1h时升高具有统计学差异(p<0.05)。4.对Notch通路的影响,与对照组相比,0.5 μ g/ml,1 μ g/ml和5μg/ml菟丝子总黄酮均能够显著提高滋养细胞的Notch1和Notch2的蛋白水平,差异具有统计学意义(p<0.01);Notch2的表达在1h和8h变化具有统计学差异,其中8h时Notch2表达显著上调(p<0.01)。结论:1.miRNA-126-3p在自然流产绒毛组织中表达上调,在滋养细胞内过表达miRNA-126-3p能抑制细胞的迁移和侵袭能力,干扰miRNA-126-3p后其迁移和侵袭能力增加。2.用米非司酮诱导已转染miRNA-126-3pmimic的滋养细胞,构建模拟自然流产状态滋养细胞模型。证实30 μmol/L的米非司酮造模后能抑制滋养细胞迁移能力,同时上调滋养细胞内miRNA-126-3p的表达。此模型的迁移和侵袭能力明显降低,miRNA-126-3p表达明显上调。3.深入研究发现菟丝子总黄酮能明显增加滋养细胞的迁移和侵袭能力,且能通过激活MAPK/AKT/Notch通路上调MMP9的表达。4.菟丝子总黄酮能下调自然流产状态滋养细胞模型内miRNA-126-3p的表达,同时提高其迁移和侵袭能力,说明菟丝子总黄酮能通过调控miRNA-126-3p来促进滋养细胞的迁移和侵袭能力。5.菟丝子总黄酮通过调控miRNA-126-3p下游的PLXNB2蛋白进一步影响自然流产状态细胞模型滋养细胞的迁移和侵袭功能。体现其安胎,防治流产的细胞药理作用。