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慢病毒(Lentivirus)是一类逆转录病毒,含有依赖于RNA的多聚酶即逆转录酶,可侵入宿主细胞内,在自身逆转录酶的作用下,以病毒RNA为模板合成cDNA,以此cDNA为模板合成双链DNA,通过病毒整合酶作用整合到宿主细胞的基因组中。以慢病毒为基础构建而成的慢病毒载体(Lentiviral vector)具有转移效率高、免疫反应小、作用范围广等优点。睾丸注射法即将病毒包装的外源DNA直接注射到雄性动物睾丸内,感染精原细胞或精原干细胞后将外源基因转染到精子,然后利用体外授精、人工授精等技术生产转基因动物的技术。该方法操作简便,但是否安全、有效,尚待验证。本试验通过分析经睾丸注射后的牛血液和精液指标,并用PCR方法检测外源DNA在睾丸内与精子整合后是否扩散到全身组织中；应用电子显微镜镜技术研究睾丸注射LV载体对牛睾丸组织的影响,旨在探讨睾丸注射法的安全性和效果,为进一步开发转基因技术奠定基础。本课题研究内容主要包括以下两个部分：：1.睾丸注射慢病毒对精液品质的影响本试验采用多点睾丸注射,注射后对实验牛多次采精,对精液进行精液常规品质检测,主要指标为密度、活力和外观色泽。将精液制成涂片,置于400倍电子显微镜下观察精子形态及密度。实验结果表明：实验组牛精液密度、活力略低于对照组牛精液,但是相差不大。在400倍电子显微镜下观察,实验组精子密度低于对照组,精子形态正常,畸形精子率低。2.血液、精液外源DNA检测本试验通过对血液常规指标分析及外源基因的PCR扩增,来确定慢病毒载体在宿主体内是否发生基因转移扩散到其他组织中。本实验室PCR方法灵敏度可达到10个拷贝数,对外源BSD基因进行扩增,对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果表明：在血液DNA及精液DNA中均未检测到外源BSD序列。3.睾丸注射慢病毒对血液生理生化指标影响血常规检测各项指标利用Microsoft Office Excel2007进行数据初步统计,并用SAS8.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)。实验结果表明：实验组与对照组血液常规检测各指标均无显著差异(p>0.05)。上述结果表明,睾丸注射慢病毒载体对牛繁殖能力及健康不会产生损害并且在宿主体内不会发生扩散,侵染其他组织。能为慢病毒载体介导RNAi技术制备转基因牛的安全性提供支持。此外本研究还可以为睾丸注射法在转基因牛的运用上提供参考。