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目的:课题组前期研究发现,STGC3基因在CNE2细胞高表达,CNE2细胞保护性自噬降低,放射敏感性增强,其机制尚待研究。本研究拟在前期结果基础上探究STGC3基因经AMPK/mTOR信号通路,介导细胞自噬对CNE2细胞放射敏感性的影响。方法:(1)构建质粒(GV147,课题组前期已完成);(2)采用脂质体瞬时转染技术将空载体质粒(RFP)和STGC3高表达质粒(RFP-STGC3)转染进CNE2细胞,分为CNE2组、CNE2-RFP组、CNE2-RFP-STGC3组,通过荧光显微镜观察各组荧光蛋白表达情况,Western Blot检测STGC3的蛋白表达;(3)经放射处理后,Western Blot检测AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白的表达;(4)AMPK是mTOR的上游信号分子,对mTOR起着负调控的作用,mTOR的激活又会抑制自噬的发生,采用AMPK激活剂二甲双胍(MET)和mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)分别处理CNE2-RFP-STGC3组干扰自噬的发生,分为CNE2组、CNE2-RFP组、CNE2-RFP-STGC3组、CNE2-RFP-STGC3+MET组、CNE2-RFP-STGC3+RAPA组,同时进行放射处理,用Western Blot检测AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白的表达,分析干扰效果;(5)采用CCK-8试验检测处理后各组细胞的细胞活力,划痕实验检测各组细胞的迁移能力,平皿克隆试验检测各组细胞的集落形成能力,评估各组细胞对放射的敏感性。结果:(1)经质粒测序检测,质粒构建成功;(2)将空载体质粒(RFP)和STGC3高表达质粒(RFP-STGC3)转染进CNE2细胞,于荧光显微镜下可见CNE2-RFP组、CNE2-RFP-STGC3组有红色荧光蛋白的表达,且表达效率高,证明RFP和RFP-STGC3成功转进CNE2细胞;Western Blot检测结果显示CNE2-RFP-STGC3组STGC3蛋白表达明显高于CNE2-RFP组及CNE2组(p<0.05),表明STGC3高表达CNE2细胞系(CNE2-RFP-STGC3)和空载体CNE2细胞系(CNE2-RFP)构建成功;(3)CNE2-RFP-STGC3组、CNE2-RFP组、CNE2组经过放射处理后,Western Blot检测结果显示CNE2-RFP-STGC3组p-AMPK的蛋白表达明显低于CNE2-RFP组及CNE2组(p<0.05),表明STGC3能够抑制AMPK的激活,CNE2-RFP-STGC3组p-mTOR蛋白的表达明显高于CNE2-RFP组及CNE2组(p<0.05),表明STGC3能够促进mTOR的激活,CNE2-RFP-STGC3组LC3-II的蛋白表达低于CNE2-RFP组及CNE2组(p<0.05),表明STGC3能够干扰自噬的发生;(4)用MET和RAPA分别处理CNE2-RFP-STGC3组,同时进行放射处理,培养24h后,Western Blot检测结果显示CNE2-RFP-STGC3+MET组p-AMPK的蛋白表达水平较CNE2-RFP-STGC3上调(p<0.05),表明MET干扰了STGC3对AMPK的负调控增加了AMPK的磷酸化,CNE2-RFP-STGC3+RAPA组p-mTOR蛋白的表达水平较CNE2-RFP-STGC3下调(p<0.05),表明RAPA拮抗STGC3抑制了mTOR的磷酸化,CNE2-RFP-STGC3+MET组和CNE2-RFP-STGC3+RAPA组LC3-II的蛋白表达水平较CNE2-RFP-STGC3组表达上调(p<0.05),表明STGC3高表达的CNE2细胞经MET和RAPA干预后,其细胞自噬水平提高(5)CCK-8提示经放射处理后CNE2-RFP-STGC3+MET组和CNE2-RFP-STGC3+RAPA组细胞活力较CNE2-RFP-STGC3组增加(p<0.05),划痕试验提示CNE2-RFP-STGC3+MET组和CNE2-RFP-STGC3+RAPA组细胞迁移能力较CNE2-RFP-STGC3组增加(p<0.05),平皿克隆试验提示CNE2-RFP-STGC3+MET组和CNE2-RFP-STGC3+RAPA组细胞克隆形成能力较CNE2-RFP-STGC3组增加(p<0.05),表明MET和RAPA能够拮抗STGC3对CNE2细胞活力、迁移能力及克隆形成的作用,使CNE2细胞的放射敏感性降低。结论:上调STGC3在CNE2细胞的表达,可抑制AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬,增强CNE2细胞的放射敏感性。