研究目的1.评价补肾清毒法、核苷酸类似物治疗CHB的临床疗效,探讨补肾清毒法治疗CHB的优势。2.了解正常人与慢性乙肝患者外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)是否具有功能上的差异,探讨慢乙肝患者体内HBV持续感染的机制。3.从细胞免疫学角度评价补肾清毒法治疗前后慢乙肝病人外周血DC的抗原提呈功能的变化,并探讨打破HBV持续感染状态可能办法。4.探讨补肾清毒法抗HBV可能的作用靶点和机理,从而阐明HBV持续感染的免疫逃避予中医伏气理论“肾虚邪伏肝血”病机的关系。研究方法1.收集49例慢性乙肝患者,随机分为两组。观察治疗前、治疗后3个月、治疗后6个月血清学指标、病毒学指标变化。2.健康人及慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养：收集肝素抗凝外周血,用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC),接种于6孔细胞培养板,添加rhGM-CSF, rhIL-4, rhTNF-a和IL-1p至第11天,荧光显微镜下采集成熟DC的图像。运用流式细胞术检测DC表面标志CD14、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达水平,并将DC与自体T淋巴细胞进行自体混合淋巴细胞反应(AMLR)鉴定DC刺激T细胞增殖的能力。3.DC刺激Th细胞亚群分泌特异细胞因子能力的测定：DC体外扩增培养至第9天后负载HBsAg至11天,取培养上清,采用ELISA法测定培养上清中IL-12、INF-γ、IL-10的含量。4.收集PBMC,分别加入FITC-CD8、PE-PD-1流式抗体,流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞中PD-1分子的表达,测定细胞免疫抑制性细胞因子的变化情况。5. HBcAg负载对DC刺激细胞增殖能力和CTL分泌IFN-γ水平的影响：HBcAg刺激培养DC,利用酶联免疫斑点试验(ELISPOT),分析抗原负载后DC对于CTL的活化,特别是IFN-γ的分泌水平的变化。研究结果1.分别对两治疗组CHB患者进行HBV-DNA定量及ALT的检测,接受治疗前,两组患者两项检测指标差异无统计学意义P>0.05。治疗3个月后,核苷酸类似物治疗组CHB患者HBV-DNA定量和ALT值明显降低,与治疗前相比有统计学意义P<0.05；补肾清毒法治疗组患者,HBV-DNA定量和ALT值较治疗前有降低趋势,但差异无统计学意义P>0.05。治疗6个月后,核苷酸类似物治疗组与治疗3个月时相比,HBV-DNA与ALT均有降低,但无统计学意义P>0.05；补肾清毒法组HBV-DNA与ALT与治疗3个月时比较,差异有统计学意义P<0.05。2.成功诱导培养健康人及CHB患者外周血单核来源DC,并进行了鉴定：在荧光显微镜下可以看到细胞体积明显增大,大量毛发样突起,呈半悬浮生长状态,具备典型DC的形态学特征。健康人外周血DC表面分子CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达高于CHB患者,比较有统计学意义P<0.05；而分别对两治疗组CHB患者进行DC表型检测,治疗3个月后,两组CHB患者DC表面分子表达水平均有不同程度的提高(CD14除外)；治疗6个月后补肾清毒法组DC表型表达水平高于核苷酸类似物组,比较有统计学意义P<0.05。3.在最适混合比1：40下,正常人DC刺激增殖SI高于CHB患者治疗前、治疗后(无HBcAg负载)和治疗后(HBcAg负载),组间比较有统计学意义P<0.05。正常人DC分泌IL-12的水平高于CHB患者,比较有统计学意义P<0.05。两组CHB患者经治疗6个月后,DC分泌IL-12水平均有提高,与治疗前相比有统计学意义P<0.05。补肾组患者IL-12水平略高于核苷酸类似物组,但无统计学意义P>0.05。治疗6个月后补肾组DC刺激Th分泌IFN-γ能力高于核苷酸类似物组,比较有统计学意义P<0.05；而两组分泌IL-10能力比较无统计学意义P>0.05。4. CHB患者治疗6个月后,补肾组病毒抗原特异性CTL频数高于核苷酸类似物组,比较有统计学意义P<0.05。补肾组CHB患者治疗6个月后CD8+T细胞表面分子PD-1的表达有所下降,与治疗前比较有统计学意义P<0.05；而核苷酸类似物组与治疗前差异比较无统计学意义P>0.05。两组患者治疗6个月后,CTL分泌IFN-γ均较治疗前升高,比较有统计学意义P<0.05。治疗6个月后,HBcAg负载DC刺激PBLs分泌出较高水平的IFN-γ,与无HBcAg负载的DC相比,其刺激强度有统计学意义P<0.05。研究结论1.短期内,核苷酸类似物治疗对于清除HBV效果明显。经长期治疗后,补肾清毒与核苷酸类似物比较能够更好使CHB患者恢复肝功能,改善临床症状,并且有效清除HBV。这可能与补肾清毒法治疗能够提高机体自身免疫功能,从而清除HBV,恢复肝功能密切相关。2.CHB患者外周血DC刺激自体淋巴细胞增殖能力下降。我们认为,与其表面黏附分子的表达下降有一定关系,可能是表面黏附分子的表达下降导致DC抗原提呈能力的下降,进而影响了DC的刺激增殖能力。提高CHB患者DC的抗原提呈能力可能有助于HBV感染者体内的病毒清除。3.两组CHB患者接受治疗后DC表型表达呈上升趋势,表明CHB患者外周血DC的黏附分子的表达得到了一定程度上调；综合表面标志表达水平、AMLR的结果,我们认为,HBcAg负载可以使治疗后患者的DC抗原提呈能力得到上调或恢复,从而使DC启动的Th和CTL细胞免疫应答得到增强或恢复。4.CHB患者CD8+T细胞表面分子PD-1的表达,在补肾清毒发经治疗后有明显下降；而T细胞共刺激分子CD137,经补肾清毒法治疗后明显上升,优于核苷酸类似物组,表明补肾清毒法可能存在改善机体的细胞免疫功能的作用。补肾清毒法作为治疗慢乙肝的有效方剂已被大量的临床及实验研究证实,其具有免疫调节作用,对多种细胞因子的调节均有影响。结合我们整个DC功能的实验究结果分析,可以推测,补肾清毒法可能对患者外周血DC的抗原提呈功能的恢复或上调具有一定作用,因而可能使免疫功能得到一定提高。