血小板无力症是一种常染色体隐性遗传病。由于患者基因缺陷导致血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物(GPⅡb/Ⅲa复合物)表达量或质的异常，血小板对多种生理性激动剂如ADP、肾上腺素、胶原和凝血酶先天性无聚集反应或反应减低，血小板在Ⅱ期生理止血过程中不能有效地聚集形成血小板栓而导致出血。主要表现为自幼出现的程度不一的出血症状，可表现为皮肤瘀斑、鼻出血、月经过多，直至致命的大出血。目前此病尚无有效常规治疗方法，而长期输注血小板又可引起输注耐受。 利用基因治疗载体将治疗基因导入患者造血干细胞，对干细胞进行体外基因修饰后再回输体内是目前血小板无力症基因治疗的研究方向之一。基因治疗可在一定程度上纠正基因缺陷，甚至达到根治目的。 选择一种安全、高效的基因转移载体是基因治疗成功的关键之一。1999年WilCOX等应用逆转录病毒载体开始了对血小板无力症进行体外修饰基因治疗的相关研究，但由于逆转录病毒载体本身的安全性问题限制了它的使用，因此需要寻求其他可能的载体。2型腺相关病毒(AAV-2)因具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可介导外源基因长期表达等特点，在既往研究中发现AAV-2对造血干细胞也具有一定的感染效率，因此选用rAAV-2作为治疗载体，研究rAAV-2介导GP Ⅱb/Ⅲa基因在体外真核细胞株中的表达情况以及相关功能研究。 本研究与国家863病毒载体研发基地合作。以基地提供的通用腺相关病毒载体质粒pSNAV-Ⅰ为基础,构建成以CMV为启动子,分别含有GP Ⅱ b和GPⅢa基因的2种重组质粒。通过转染BHK-21细胞,经G418选择培养,分别得到包装病毒用的载体纽胞株。再用rAAV2的包装辅助病毒感染载体细胞株,细胞病变完全后行细胞裂解、酚氯仿抽提、纯化后得到2种携带GPⅡb和GPⅢa基因的重组AAV病毒。经PCR、HPLC、电镜等多种方法检测,证明所构建的这2种重组AAV病毒构建正确,纯度好。并通过点杂交的方法测定病毒滴度。 本研究采用多种方法,从不同水平检测了rAAV2介导的GP Ⅱ b/Ⅲa在体外真核细胞株(BHK-21)的表达,并且同时分析了不同感染剂量与GP Ⅱ b和GPⅢa基因表达量之间的关系。并且通过PAC-I实验检验所表达的GP Ⅱ b和GPⅢa蛋白的功能。结果表明:在MOI为1×10<5>的条件下,感染24小时后即可在转录水平检测到GP Ⅱ b和GPⅢa基因的表达;48小时可在蛋白水平检测到GPⅡb和GPⅢa基因表达,感染48小时后免疫荧光亦可在BHK-21细胞表面检测所表达目的基因产物。在量效研究中发现,在一定剂量范围内GP Ⅱ b和GPⅢa,蛋白表达量随着MOI的升高而增加,但由于rAAV受体竞争性抑制的存在,过高的MOI反而是表达量下降。PAC-Ⅰ结合结果表明目的基因表达产物经ADP活化后能与PAC-Ⅰ结合,具有正常的生物学活性。 本研究表明:rAAV2载体能够有效的介导GP Ⅱ b和GPⅢa基因在体外细胞株中的表达,并且所表达产物具有正常的生物学活性。为重组腺相关病毒载体介导血小板无力基因治疗的下一步研究打下了良好的工作基础，为目前病毒载体介导基因治疗技术提供新的参考。本研究也为血小板无力症致病机理以及GP Ⅱ b／Ⅲa复合物功能研究的深化提供新的研究工具和手段。