乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染机体后所引起的疾病。乙肝流行面广、传染性强、易于慢性化和重症化，并且以人类为惟一宿主，因此对人类健康造成了很大伤害。HBV是一种嗜肝DNA病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。HBV感染肝细胞的机理比较复杂，尚未完全明确。目前，控制乙型肝炎传播最为直接和有效的措施是接种乙肝疫苗。在HBV感染期间，肝细胞大量分泌20nm的外膜主蛋白颗粒，由细胞系或酵母方法制备的同样颗粒就是有效预防病毒感染的疫苗。乙肝疫苗经历了乙肝病毒外膜主蛋白（即S蛋白，HBsAg）重组疫苗；乙肝病毒外膜主蛋白、中蛋白（前S2蛋白+S蛋白）及大蛋白（前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白）重组疫苗；乙肝DNA疫苗等几个阶段。这些疫苗虽然能够有效地降低HBV母婴传播的发生率，然而在人体保护率、抗体应答水平、免疫持久性等方面还存在一定的问题。因此，寻找免疫原性更强的HBV疫苗成为当前研究的热点。HBV的外膜由开放读框S基因（S-ORF，核苷酸nt2854-0-832）编码合成，包括3种外膜成分：大蛋白（L），中蛋白（M）和主蛋白（S），它们由1个开放读码框编码，分别使用3个起始密码子和1个共同的终止密码子。外膜蛋白主要是由226个氨基酸组成的主蛋白HBsAg，是携带全部抗原反应性的结构蛋白。M是在S的氨基端扩加55个氨基酸（前S2蛋白），前S2蛋白在外膜三种蛋白成分中的免疫原性最强；L是在M前再扩加108-119个氨基酸（前S1蛋白）。病毒附着于肝细胞，最重要的介导部位就是前S1蛋白的氨基端21-47肽段，前S1/AA21-47区段比较保守，只要这一段完整，变异的病毒就具有传染性。因此，在构建HBV主蛋白疫苗的基础上加入其他蛋白成分，如前S1蛋白、前S2蛋白以及C蛋白等会有助于提高疫苗的免疫原性。乙肝病毒的外膜蛋白在病毒颗粒分泌、附着及入侵新细胞中具有重要的介导作用，而且三种外膜蛋白均有较多的抗原表位。因此，构建同时含有preS1、preS2的蛋白可以更好的诱导机体的免疫应答。本课题依照这个思路，以获得具有更高免疫原性的HBV疫苗为目的进行基础性探索，主要研究内容及结论如下：第一部分：HBV/preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达。根据外膜蛋白的跨膜特性将大外膜蛋白人为地分为6段并设计了6对引物，经PCR扩增后，分别使扩增产物在前S1、前S2编码区的5’端加入尿激酶原的信号肽序列、6*组氨酸（HIS），3’端加入HA标签的编码序列和EGFP片段。这6段扩增产物含有跨膜区的编码序列。由于HBV前S1的氨基端锚定于细胞膜上，本实验设计PCR扩增产物不含有前S1蛋白氨基端前11个氨基酸的编码区。构建好的载体转染人肾上皮293细胞，以观察绿色荧光，Westernblotting及激光共聚焦等方法检测蛋白在细胞内外的表达情况。最后获得了可以较高表达目的蛋白的HBV/（preS1-preS2-HBsAg）pcDNA3.1/293细胞株，为下一步探讨治疗性疫苗的研究提供了参考。第二部分：HBV/(preS1-preS2-FC)、HBV/(preS1-FC)真核表达载体的构建及在293细胞中的表达和纯化。根据第一部分的提示和结果设定采用重叠延伸PCR方法连接信号肽与各目的基因，将编码乙肝病毒S1抗原、S2抗原和连接入含有人IgG1Fc段的pcDNA3.1表达载体。其中加入人IgG1Fc段可以提高免疫原性，应对目前乙肝疫苗存在的抗体应答水平和免疫保护率不高等不足。采用阳离子脂质体法转染293细胞，经G418加压筛选阳性克隆。最后获得了可以较高表达目的蛋白的HBV/preS1-preS2-Fc、HBV/(preS1-FC)pcDNA3.1/293细胞株。