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RUNX1和RUNX2是转录因子RUNX家族成员，在人和鼠的卵泡发育和排卵等多种生殖过程中扮演着重要的角色，然而它们在奶山羊卵泡中的表达调控机理仍不是十分清晰。因此，本研究以关中奶山羊卵巢颗粒细胞为研究对象，使用免疫组化、免疫荧光、real-time PCR、western blot、ELISA、CCK-8、EdU和流式细胞术等方法，研究了hCG、miR-181b和miR-222在关中奶山羊卵巢颗粒细胞中对RUNX1和RUNX2的表达调控机理，以及RUNX1、RUNX2、miR-181b和miR-222对奶山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡以及激素分泌的作用。主要研究结果如下： 1．RUNX1和RUNX2在关中奶山羊卵巢组织中的表达分析 Real-time PCR的结果显示，RUNX1和RUNX2mRNA在关中奶山羊的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、乳腺、子宫、输卵管和卵巢组织中均有表达，在乳腺中表达量最高，在肌肉中表达量最低。免疫组化分析结果表明，RUNX1和RUNX2蛋白在腔前卵泡的颗粒细胞和卵母细胞，有腔卵泡的颗粒细胞、卵母细胞和膜细胞，以及黄体中表达。 奶山羊卵巢颗粒细胞经过1IU/mL hCG处理0、2、4、8、12、16、24h后发现，RUNX1和RUNX2mRNA表达水平在2h时显著增加，hCG以时间依赖的方式持续促进RUNX1和RUNX2的蛋白表达。接着，通过加入hCG调节的信号通路的激活剂和抑制剂发现，在2h时，hCG诱导RUNX1mRNA的表达依赖于PKC和PI3K的激活，而hCG诱导RUNX2mRNA的表达依赖于cAMP、PKC和PI3K的激活。 3．MiR-181b和miR-222对hCG诱导RUNX1和RUNX2表达的作用 使用生物信息学分析发现，RUNX13UTR区有一个miR-181b结合位点，RUNX23UTR区有一个miR-221/222结合位点（miR-221和miR-222具有相同的种子序列）。构建野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体，分别和NC、miR-181b、miR-221和miR-222mimics转染293T细胞和奶山羊卵巢颗粒细胞24h后发现，miR-181b可以与RUNX13UTR区结合降低荧光素酶活性，miR-222可以与RUNX23UTR区结合降低荧光素酶活性。Real-time PCR和western blot结果显示，miR-181b下调RUNX1mRNA和蛋白的表达，miR-222抑制RUNX2mRNA和蛋白的表达，说明RUNX1是miR-181b的一个靶基因，RUNX2是miR-222的一个靶基因。 奶山羊卵巢颗粒细胞经1IU/mL hCG处理0、2、4、8、12、16、24h后发现，miR-181b的表达水平显著下降并始终维持在较低水平；而miR-222的表达量在hCG处理2、4和12h时显著增加，4h最高，其他时间则无变化。接着，通过加入hCG调节的信号通路中的激活剂和抑制剂发现，在4h时，hCG通过激活cAMP/PKA和PKC信号通路抑制miR-181b的表达，hCG则通过激活PKC和PI3K信号通路促进miR-222的表达。 转染野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体24h，加入DMSO、hCG、FSK和PMA继续培养4h后，hCG和PMA可以显著增加RUNX1-3UTR组的荧光素酶活性；而只有hCG能够显著降低RUNX2-3UTR组的荧光素酶活性降低。说明，miR-181b和miR-222直接参与调节hCG诱导的RUNX1和RUNX2的表达。 4．RUNX1和RUNX2对奶山羊卵巢颗粒细胞激素分泌和增殖凋亡的效果 用1IU/mL hCG对奶山羊卵巢颗粒细胞处理0、2、4、8、12、16、24h后发现，hCG在12h和16h时显著增加了培养液中雌激素的浓度。然后，使用siRNA成功干扰了RUNX1和RUNX2的表达。在无hCG处理时，降低RUNX1的表达可以显著抑制雌激素的生成，但是对孕酮生成无影响；降低RUNX2的表达对孕酮和雌激素的生成均无影响。在有hCG处理时，干扰RUNX1和RUNX2的表达可以抑制hCG诱导的孕酮生成，而对hCG诱导雌激素的生成没有作用。抑制RUNX1和RUNX2的表达均可以显著降低类固醇激素合成酶基因StAR、HSD3B和CYP11A1mRNA的表达水平和hCG诱导的StAR、HSD3B和CYP11A1mRNA表达量，而对CYP19A1mRNA的表达和hCG诱导的CYP19A1mRNA表达水平无影响。通过对StAR、HSD3B和CYP11A1基因启动区转录活性分析发现，它们的启动子区均含有多个RUNX1和RUNX2结合位点，且RUNX1可以分别与CYP11A1启动子区-266~-256和-252~-242、HSD3B启动子区-1805~-1795、-1681~-1671和-1327~-1317、StAR启动子-1180~-1170、-1084~-1074和-258~-248相结合正向调节它们的转录；RUNX2可以分别与CYP11A1启动子区-255~-241、HSD3B启动子区-1808~-1794、-1684~-1670和-1330~-1316、StAR启动子-1087~-1073结合正向调节它们的转录。 CCK-8和EdU染色结果表明干扰RUNX1和RUNX2的表达在24h时可以显著促进奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖。接着，流式细胞术的结果说明在48h时，干扰RUNX2的表达可以显著抑制奶山羊卵巢颗粒细胞凋亡，过表达RUNX2则能显著促进奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡；而RUNX1对奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡无明显作用。 5．MiR-181b和miR-222对奶山羊卵巢颗粒细胞激素分泌和增殖凋亡的作用 使用ELISA检测miR-181b和miR-222对奶山羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响，无论hCG存在与否，miR-181b和miR-222对培养液中孕酮的浓度都没有影响，而miR-222则可以刺激奶山羊卵巢颗粒细胞雌激素的生成。接着EdU检测结果发现，miR-181b和miR-222在48h时显著促进了奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖。流式细胞术的结果表明，在48h时，miR-181b能够抑制奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡，而miR-222则对奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡无影响。 综上所述，在关中奶山羊卵巢颗粒细胞中，miR-181b和miR-222不仅受到了hCG的调节，还直接参与调控hCG诱导RUNX1和RUNX2的表达。RUNX1和RUNX2可以直接与StAR、HSD3B和CYP11A1启动子区结合促进它们的转录，进而促进hCG诱导的孕酮的生成。除此之外，RUNX1、RUNX2、miR-181b和miR-222参与调节奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡。以上研究结果为进一步阐明RUNX1和RUNX2在调控卵泡发育及卵巢功能的机理提供了试验依据。