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糖尿病是严重威胁人类健康的慢性病之一,其中90%以上为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者。糖尿病曾是人工种植体的禁忌证,但新的研究表明良好的血糖控制可提高糖尿病患者人工种植牙成功率。目前控制血糖最常用最有效的药物是胰岛素。刘洪臣等提出胰岛素局部给药对成骨细胞有保护作用,并在临床成功应用于糖尿病患者种植体局部获得良好效果。课题组通过体外实验已经证实适量浓度胰岛素影响成骨细胞的增殖和分化,而且发现成骨细胞上有胰岛素受体的表达。胰岛素必须与受体结合才能发挥其生理学效应,受体的数目和与胰岛素的亲和力同胰岛素的生物学效应有直接关系。胰岛素受体(insulin receptor, IR)和胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(insulin-like growth factor-I receptor,IGF-IR)属于胰岛素样生长因子系统家族(insulin like growth factors, IGFs)的受体酪氨酸激酶,虽然两者具有高度相似的分子结构和细胞内信号系统,但是IR和IGF-IR在代谢过程、细胞增殖分化中发挥着不同作用,尤其将胰岛素局部应用于糖尿病大鼠拔牙窝后两种受体的表达和变化尚不清楚。Goto-Kakizaki (GK)大鼠是与人类2型糖尿病近似的自发性非肥胖2型糖尿病鼠种,主要表现为葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损出现的胰岛素分泌绝对不足。本实验选用适宜生理浓度的胰岛素,利用壳聚糖／β-甘油磷酸钠凝胶(chitosan/β-glycerophosphate, C/GP)系统,将胰岛素溶液凝胶化后局部注射到GK大鼠拔牙窝中,观察IR和IGF-1R的表达与变化以及拔牙窝愈合过程中新生骨组织形成,初步探讨两种受体在糖尿病大鼠拔牙窝愈合过程中的作用。第一部分胰岛素对下颌骨成骨细胞增殖的影响及IR和IGF-1R在成骨细胞上的表达目的：探讨适宜浓度对成骨细胞生长增殖的影响,观察IR和IGF-1R在成骨细胞上的表达方法：原代培养Wistar大鼠下颌骨成骨细胞并鉴定,分别用正常及高糖浓度的培养液配制的不同浓度梯度胰岛素溶液,然后以不同浓度胰岛素液通过培养成骨细胞用噻唑蓝法(MTT法)检测成骨细胞的增殖,确定药物最适浓度；免疫组织化学法检测体外成骨细胞上IR和IGF-1R的表达结果：通过酶消化法成功培养了原代大鼠下颌骨成骨细胞；在相同浓度胰岛素条件下MTT结果显示成骨细胞在低糖培养基中增殖活跃；在四组不同胰岛素浓度10-6M浓度下成骨细胞增殖最为显著。在体外成骨细胞上IR和IGF-1R均阳性表达。结论：高糖条件抑制了大鼠下颌骨成骨细胞的增殖；在两种糖浓度下,10-6M胰岛素能显著促进大鼠下颌骨成骨细胞的增殖；而且成骨细胞均表达IR和IGF-1R蛋白。第二部分胰岛素凝胶缓释系统的制备目的：用C／GP凝胶系统结合胰岛素制备胰岛素缓释凝胶,并检测胰岛素凝胶效能方法：高效液相色谱法测定胰岛素局部给药凝胶系统释出胰岛素的量及释放趋势,同时检测胰岛素凝胶系统中β-甘油磷酸钠浓度、pH值对于凝胶系统从水溶液转变为凝胶时间的影响以及释出胰岛素影响结果：C／GP凝胶系统在25℃下呈液态,37℃时约8min形成凝胶,凝胶形态良好,并且在负载了胰岛素溶液后壳聚糖／β-GP凝胶形态未受影响；GP含量、pH值影响C／GP系统胶凝时间；GP在C／GP系统中终含量为5.6%时胰岛素体外释放较为理想结论：成功制备了胰岛素壳聚糖／β-甘油磷酸钠凝胶系统,确定了适当的GP含量和pH值范围。第三部分胰岛素凝胶局部给药促进GK大鼠拔牙窝愈合作用的观察及IR和IGF-1R在拔牙窝愈合过程中的表达及变化目的：通过组织学、免疫组织化学观察IR和IGF-1R在GK大鼠拔牙窝愈合过程中成骨情况的表达及变化,探讨胰岛素通过两种受体影响糖尿病大鼠拔牙窝愈合的机理方法：手术拔除大鼠下颌骨左侧切牙；拔牙窝局部注射胰岛素凝胶,设4组：正常大鼠拔牙组(WN)；GK大鼠拔牙组(GN)、GK大鼠无胰岛素C／GP凝胶注射组(G1)、GK大鼠胰岛素C／GP凝胶注射组(G2)；分别在拔牙后7d,14d,21d,28d取材,通过X线观察、组织形态学、免疫组织化学法及qPCR观察IR和IGF-1R在GK大鼠拔牙窝愈合过程中的表达及变化,分析胰岛素结合两种受体与下颌骨拔牙窝愈合的机理。结果：注射C／GP凝胶于下颌骨拔牙窝后,G2组大鼠血糖检测无统计学差异；免疫组织化学观察IR和IGF-1R均在成骨细胞的胞浆上阳性表达,IGF-1R阳性表达细胞多位于拔牙窝新生骨小梁周围,IR阳性表达的细胞位于拔牙窝内骨陷窝周围；IGF-1R阳性表达的细胞多于IR阳性表达的细胞。HE染色观察在G1,G2组28d时未见有c／GP；Goldner’s三色法观察G2组在拔牙后28d拔牙窝内出现不规则骨基质和少许的新生骨小梁,围绕新生骨小梁周围的成骨细胞明显活跃,立方形、多边形的成骨细胞多见。在大鼠拔牙窝7-28d愈合过程中,WN组IR mRNA水平表现为持续下降,GN组则表现为IRmRNA水平在14d达到高峰后开始下降为先升高后降低的趋势,G1组也表现为先升高后降低趋势,21d时达到高峰,随后在28d时降到7d时水平,G2组与WN组表现一致,在7-28d过程中持续下降,其中GN组的IRmRNA水平最高(p<0.01),G1、G2组与WN组相近均低于GN组；此过程中GN、G1组的IGF-1RmRNA水平较低,G2组在7d,14d,21d明显高于其它两组,并在21d时达到峰值,WN组14d,21d显著高于GN、G1组(p<0.01)结论：胰岛素缓释的凝胶系统局部注射于大鼠拔牙窝内,未即刻改变大鼠血糖；胰岛素局部应用于拔牙窝改变了IR和IGF-1R水平,促进糖尿病大鼠拔牙窝中新生骨形成。