前言　　 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病共同的病理基础，也是心血管系统疾病中最常见的疾病，严重危害人类健康。目前认为动脉粥样硬化是由单核/淋巴细胞黏附并激活内皮细胞而导致的一种慢性炎症性疾病，动脉粥样斑块的形成过程是以低密度脂蛋白为主的各种脂质成分在血管内皮下聚集，继而白细胞渗出、泡沫细胞形成、血管平滑肌增生以及大量结缔组织形成的病理过程。　　 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类含锌的可降解细胞外基质中多种蛋白成份的内肽酶家族，其细胞来源极其丰富，可由正常组织细胞、炎症细胞及肿瘤细胞产生，并且在许多生物活性物质，如细胞因子、自由基和氧化型低密度脂蛋白等刺激下可异常表达，参与多种病理生理过程，如肿瘤的侵袭与转移、炎症、胚胎发育及血管再生等。MMPs参与AS斑块的形成，并且由于其能降解细胞外基质，削弱纤维帽对斑块的保护作用，降低AS斑块中脂质含量而被认为是引发斑块破裂的最重要细胞因子。因此抑制MMPs的表达可以有效预防斑块破裂，缓解动脉粥样硬化。　　 由于动脉粥样硬化是血管壁的慢性炎症性疾病，而细胞因子广泛地参与了炎症的发生、发展过程，所以细胞因子在动脉粥样硬化中具有重要的作用和意义。　　 单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是单核/巨噬细胞特异的趋化性因子，其主要功能是趋化和激活单核/巨噬细胞至炎症部位，参与炎症反应、调节免疫，并促进动脉粥样硬化的形成。细胞白介素-6(Interleukin-6，IL-6)亦参与血管炎症反应，为促动脉粥样硬化的因子。因此，抑制这两种细胞因子的表达可以抑制动脉粥样硬化病灶的形成。　　 在AS斑块形成和血脂紊乱的基础上，常伴随着血小板的异常激活。血小板参与了AS斑块形成的全过程，即血小板本身有致斑块性，血小板参与体内血脂调节、促进炎症及致氧化应激作用。所以有效抑制血小板的活性可以减缓AS的发生与发展。　　 三七为五加科植物参三七的根，主产于云南、广西等省。三七含有多种化学成分，其中三七总皂苷(toral saponins of panax notoginseng，PNS)为主要有效活性成分，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1为从中提纯所得的单体皂苷。三七皂苷对心脑血管系统、血液系统、神经系统、免疫系统等均具有广泛的作用，而且能抗肿瘤、抗衰老等，临床上广泛地应用于心血管疾病、肝炎、外科疾病的治疗。因此，三七是一味具有广阔开发应用前景的药物。但是其抗动脉粥样硬化的具体机制研究较少，其单体成分人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1在治疗动脉粥样硬化中的作用尚不明确。　　 本实验中我们用Real time RT-PCR技术检测不同浓度PNS，Rb1，Rg1对巨噬细胞分泌IL-6，MCP-1的影响；利用the microchip flowchamber system观察不同浓度PNS，Rb1，Rg1对血小板凝集的影响；用明胶酶谱实验观察不同浓度PNS，Rb1，Rg1对人脐静脉内皮细胞MMP-2活性的影响。进而探讨三七皂苷在抗动脉粥样硬化中的作用机制。　　 实验方法　　 一、细胞培养　　 (一)THP-1源性巨噬细胞的培养　　 将THP-1细胞置于含10％FBS的PRMI1640培养液中，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养。细胞悬浮生长，在用PMA(50ng/ml)刺激贴壁分化为巨噬细胞后用于实验。　　 (二)人脐静脉内皮细胞的原代分离与培养　　 将取来的脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提前盛有预热PBS培养皿中，剪去有钳央痕及血肿的部分，挤出脐带中的残血，用剪刀修齐两断面。找出脐静脉，用带平针头的注射器从一端插入脐静脉，血管钳固定，再用预热的PBS冲洗3次发上，将血迹完全冲洗干净。从冲洗的针头中注入0.25％胰酶消化液使其充盈。取出针头，用止血钳央住注入端，移入无菌烧杯中，置于37℃培养箱中孵育7min。取出烧杯，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10％胎牛血清的DMEM培养液再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1000转/min，离心6min，弃上清，加入DMEM完全培养液(含20％胎牛血清)，用巴氏吸管轻轻吹打均匀，3×104/cm2接种于培养皿，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，24h后更换培养液去除未贴壁的细胞，然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满皿底。待细胞生长达亚融合状态进行传代，2代细胞用于实验。　　 二、Real time RT-PCR检测巨噬细胞IL-15和MCP-1mRNA的表达　　 收集待测巨噬细胞，进行RNA抽提，反转录后按下列条件在荧光定量PCR仪上扩增：GAPDH：95℃10sec1Cycle；95℃10sec，61℃20sec，72℃30sec，45Cycle；IL-6:95℃10sec1Cycle；95℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，45Cycle；MCP-1:95℃10sec1Cycle；95℃10sec，56.3℃20sec，72℃30sec，45Cycle；最后计算mRNA的相对表达量。每个样本设3个复孔。　　 三、体外血小板凝集试验　　 取人新鲜血液于含枸橼酸钠的试管中，混匀，再将血浆分装至EP管(380μl/管)室温静置1小时。每管加入20μl用生理盐水稀释的PNS，Rg1，Rb1，使终浓度为：PNS浓度分别为0,200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml：Rb1浓度分别为0,50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml：Rg1浓度分别为0,50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml；上下摇晃3次混匀，5分钟后使用Themicrochipflowchambersystem检测血小板凝集。　　 四、明胶酶谱实验测定人脐静脉内皮细胞中MMP-2的活性　　 取对数生长期人脐静脉内皮细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2×105/ml，接种于24孔板，培养24h后去上清；加入无血清培养液继续培养24小时，使细胞生长同步化；再次吸出培养液，分别加入含有200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，PNS：50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml，Rb1及50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml，Rg1的无血清DMEM培养液，以不含三七皂苷的孔为对照组，每浓度平行3孔，继续培养24小时后取上清。上清按5:1与上样缓冲液混合室温放置10min，上样于7.5％SDS-PAGE胶中，4℃，60mA恒流电泳，待样品达胶底端时电泳结束。电泳所得凝胶依次洗脱(30min，两次)，孵育(37℃，20h)，用考马斯亮蓝染色4h，再脱色。凝胶图像扫描入计算机后用ImageJ图像处理软件对条带进行半定量分析。　　 五、统计学分析　　 各组实验重复三次。应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析和处理，实验数据以x±S表示，统计方法采用Student’st-test和配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果　　 一、PNS，Rb1，Rg1对巨噬细胞炎症因子IL-6，MCP-1表达的影响　　 不同浓度的药物作用THP-1分化成的巨噬细胞24小时后，RealtimeRT-PCR检测巨噬细胞IL-6和MCP-1的mRNA相对表达量。结果显示不同浓度的PNS和Rb1均可抑制LPS刺激后巨噬细胞产生的细胞因子IL-6，MCP-1mRNA的表达且呈浓度依赖效应。而Rg1作用组与对照组没有明显差异。　　 二、PNS，Rb1，Rg1对血小板凝集的影响　　 药物与新鲜血浆混合后，用The microchip flowchamber system检测血小板凝集情况，得到血小板凝集时间及压力曲线。　　 PNS浓度为500μg/ml，1000μg/ml时可显著延长血小板凝集时间，抑制血小板凝集，呈浓度依赖效应。　　 Rb1浓度为200μg/ml，500μg/ml时可显著延长血小板凝集时间，抑制血小板凝集，呈浓度依赖效应，且此种作用强于PNS。　　 Rg1作用组与对照组相比对血小板凝集均无影响。　　 三、PNS，Rb1，Rg1对HUVEC分泌的MMP-2活性的影响　　 明胶酶谱实验检测经不同浓度PNS，Rb1，Rg1作用后，HUVEC细胞中MMP-2的活性。　　 PNS浓度为500μg/ml及1000μg/ml时，MMP-2的活性较对照组减弱。　　 Rb1各浓度作用于HUVEC24小时后MMP-2活性较对照组无明显差异。　　 Rg1浓度为50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml时作用于HUVEC24小时后MMP-2的活性较对照组减弱且呈浓度依赖效应。　　 结论　　 1、PNS及其单体成分Rb1可以抑制由LPS诱导的巨噬细胞炎症因子IL-6及MCP-1mRNA的表达；Rg1对炎症因子mRNA表达无抑制作用。　　 2、PNS及其单体成分Rb1可以延长体外血小板凝集时间，抑制血小板凝集；Rg1对体外血小板凝集无影响。　　 3、PNS及其单体成分Rg1可以抑制人脐静脉内皮细胞中基质金属蛋白酶MMP-2的活性；Rb1对MMP-2的活性无明显影响。　　 推测PNS可以通过抑制巨噬细胞炎症因子表达、抗血小板凝集作用及抑制基质金属蛋白酶活性而具有抗动脉粥样硬化作用。