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牙鲆Paralichthys olivaceus属于海水鱼类,在我国的经济价值较高,其胚后发育阶段经历了剧烈的变态现象,对其变态发育机制的研究已成为热点,一些异时性基因(heterochronic genes)如let-7、lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29等在很多脊椎动物中呈现出保守的时空性调控表达模式,在生物发育过程中进行精准有序地调控表达,对这些基因的研究有助于牙鲆变态发育分子机制的阐明。let-7 miRNAs类似于其他的microRNAs,主要作用于靶基因的3’-UTR序列。LIN-28a及其同源分子LIN-28b是RNA结合蛋白,LIN-41是细胞质蛋白,LIN-29是多锌指结构蛋白,它们都与生物发育时空性紧密相关。本课题组在对牙鲆的变态发育研究中已鉴定得到牙鲆10个let-7 miRNAs并对其在牙鲆发育中的表达进行了相对定量检测。本论文主要研究其余四个异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29的克隆、表达分析及其在牙鲆变态发育中与let-7的调控关系。本论文以牙鲆总cDNA为模板,采用PCR等克隆获得牙鲆lin-28a、lin-28b和lin-29基因cDNA全长及lin-41的编码区序列(Coding sequence,CDS),利用生物信息学方法分别分析它们的氨基酸序列、不同物种间同源性比较、构建进化树及预测蛋白三级结构;通过实时荧光定量PCR技术在牙鲆成鱼多个组织和不同发育时期的仔鱼中检测各个异时性基因的相对表达量及外源性th和tu对变态期牙鲆仔鱼各异时性基因表达水平的影响;预测得到牙鲆let-7mirnas的靶基因(lin-28a和lin-28b)并进行验证;构建牙鲆lin-28a和lin-28b基因的真核表达载体并将其和let-7mirnasmimicis在牙鲆胚胎细胞(fecs)中分别进行过表达及后续检测试验。以期初步揭示牙鲆早期发育中这些异时性基因的作用和相互关系,为进一步研究牙鲆变态发育调控通路提供基础性资料。lin-28a基因全长1617bp,包括118bp的5’-utr、890bp的3’-utr和609bp的开放阅读框,编码202个氨基酸;lin-28b基因全长2998bp,包括218bp的5’-utr、2075bp的3’-utr和705bp的开放阅读框,编码234个氨基酸;lin-29基因全长1769bp,包括112bp的5’-utr、328bp的3’-utr和1329bp的开放阅读框,编码442个氨基酸;lin-41的开放阅读框有2502bp,编码833个氨基酸。牙鲆四个异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29的氨基酸序列与其他物种的同源性分别在62%~94%、63%~93%、70%~93%和68%~95%,进化树分析显示牙鲆四个异时性基因均与其他鱼类同源基因聚为一支,这些基因的氨基酸序列在不同物种间具有相同或相似的蛋白结构,进化和功能方面具有保守性。牙鲆异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-29和lin-41在牙鲆成鱼的脑和性腺中都有较高的表达量,尤其是lin-28a和lin-28b在脑和性腺中呈现很突出的高表达(p<0.05),表明它们在牙鲆脑和性腺发育中具有重要作用;在牙鲆胚胎至仔鱼各时期发育中的定量结果显示lin-28a、lin-28b和lin-41的表达模式与牙鲆let-7相反,说明三者可能与let-7存在负向调控关系,lin-41和lin-29在牙鲆成鱼其余各组织中也均有较高的表达量可能与其结构及功能多样性相关(p<0.05)。本研究结果显示外源th对lin-28a、lin-28b、lin-29和lin-41都没有特定规律性促进或抑制其表达的作用,th抑制剂tu促进了它们的表达(p<0.05),th拯救试验又都使四个异时性基因的表达向th处理组的水平发展,表明th可能间接调控这些基因的表达。对牙鲆异时性micrornaslet-7的靶基因验证试验中,牙鲆lin-28a3’-utr区的三个预测靶位点中只有第二个位点受到let-7的靶控作用,其实验组的萤火虫荧光素酶相对活性明显减弱(p<0.05),且三个位点共同存在时受到let-7的靶向抑制作用最强(p<0.01),表明牙鲆lin-28a是let-7的靶基因且其3’-utr区域至少存在一个靶位点,及lin-28a受不同let-7的靶向抑制作用程度之间有差异。将重组真核过表达载体pegfp-n1-lin-28a、pegfp-n1-lin-28b和let-7mirnas在牙鲆胚胎细胞中过表达后,细胞中有绿色荧光融合蛋白表达,表明载体转染成功且在牙鲆胚胎细胞中表达;pegfp-n1-lin-28a和pegfp-n1-lin-28b重组质粒在fecs中过表达均有使牙鲆pre-let-7的表达堆积和let-7mirnas的表达减少的作用(p<0.05),表明牙鲆异时性基因lin-28a和lin-28b在fecs中对牙鲆let-7mirnas转录后的加工成熟有负调控作用;lin-28a和lin-28b还直接或间接地上调了lin-29的表达;lin-28a过表达使牙鲆胚胎细胞的增值能力提高,综上结果表明在牙鲆胚胎细胞中lin-28a有促进细胞分裂增殖的作用,lin-28a和let-7在牙鲆中形成了负反馈调控通路,对牙鲆发育有重要作用。总之,本研究分析了异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-29和lin-41在牙鲆成鱼各组织和早期发育时期的表达谱,以及外源TH分别对四个异时性基因的影响;初步验证了牙鲆let-7 miRNAs的靶基因lin-28a;构建了真核表达载体pEGFP-N1-lin-28a和pEGFP-N1-lin-28b并分析其对牙鲆胚胎细胞周期的影响及与let-7的调控关系,而且这种调控关系初步认为是负反馈调控。