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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种和年龄相关的神经退行性疾病,导致认知功能的逐步丧失。在AD的病理过程中,小胶质细胞和星形胶质细胞被激活,产生一系列免疫反应产物,其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）是胶质细胞产生的主要细胞因子。本课题组前期的研究工作已经证实:AD模型大鼠脑中海马区和皮质额叶区,炎症因子TNF-α和IL-1β的含量显著增高。经中药治疗后海马组织和皮质额叶中TNF-α和IL-1β含量显著降低。国内外的文献报导,在中风、脑损伤、帕金森氏症等其他脑病中,患者脑中均有不同程度的炎症反应。其中,炎症因子TNF-α和IL-1β在患者脑中大量表达,并与胶质细胞介导的炎症反应一起广泛存在。因此,将炎症因子TNF-α和IL-1β作为我们的研究对象,对脑病炎症发病机制的深入研究和中药从炎症论治脑病的生物学机制研究都具有普遍意义。本人的实验目标是,在体外建立稳定表达炎症因子TNF-α和IL-1β的细胞系。在成功建立细胞系的基础上,进行中药从炎症治疗脑系疾病的分子生物学机制研究,为中药分子药理学和药物靶点的研究提供合适的细胞模型和实验手段。目的:在体外,构建带有炎症因子TNF-α和IL-1β基因序列的真核表达载体;进一步在哺乳动物真核细胞上,构建稳定表达炎症因子TNF-α和IL-1β的细胞系。方法:1以克隆载体pCMVSport-TNF-α和pCMVSport-IL-1β为扩增模板,使用高保真聚合酶进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）,获得目的基因（即炎症因子TNF-α和IL-1β的基因序列）;2将真核表达载体pFLAG-CMV、pcDNA3.1和扩增得到的目的基因TNF-α、IL-1β分别进行双酶切反应,并通过连接反应,将目的基因TNF-α、IL-1β分别连入真核表达载体pFLAG-CMV、pcDNA3.1;3对重组质粒进行单酶切（与空载体比较）、PCR扩增反应和目的基因碱基测序,鉴定四种重组质粒,即pFLAG-CMV-TNF-α、pFLAG-CMV-IL-1β、pcDNA3.1-TNF-α、pcDNA3.1-IL-1β,是否构建成功。4选取HEK293细胞,使用脂质体介导的方法进行转染,采用重组真核表达载体pFLAG-CMV-TNF-α和pFLAG-CMV-IL-1β转染真核细胞HEK293。转染后48小时,进行G418的抗性筛选,加入G418后的第2天,细胞形态出现明显变化;加入G418后的第6天,细胞开始出现大量死亡;加入G418后的第10天,出现单克隆细胞,并将细胞消化至48孔板中,保证每孔一个细胞,改变G418的浓度为维持浓度,即筛选取浓度的一半;加入G418后的第21天,单克隆细胞长至细胞集落,并呈现岛状;继续培养1-2周,细胞长满整个培养孔,进行消化细胞,传代,冻存或是裂解检测。5蛋白质印迹（Western blot）方法检测上述获得的细胞系中炎症因子的表达情况。首先,裂解细胞,使用标准蛋白制作蛋白标准曲线,确定上样量,利用炎症因子TNF-α和IL-1β的抗体,进行目的蛋白表达水平的检测。结果:1以克隆载体pCMVSport-TNF-α和pCMVSport-IL-1β为扩增模板,成功扩增目的基因。琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因TNF-α和IL-1β均在预期位置,即TNF-α大小位置在700bp,IL-1β大小位置在800bp。已知目的基因TNF-α大小为701 bp,IL-1β大小为809bp。2重组质粒构建成功。重组质粒pFLAG-CMV-TNF-α、pFLAG-CMV-IL-1β、pcDNA3.1-TNF-α、pcDNA3.1-IL-1β经限制性内切酶HindⅢ单酶切,所得片段均大于空载体单酶切片段大小、经PCR反应均扩增得到目的片段。对重组质粒进行基因测序,使用DNAStar软件将测序结果与GeneBank中人类TNF-α和IL-1β进行序列比对分析,结果显示,目的基因与GeneBank中一致。表明,目的基因准确无误连入真核表达载体。已知GeneBank中人类TNF-α序列号为NM000594、人类IL-1β序列号为NM000576。3稳定表达炎症因子TNF-α和IL-1β细胞株成功建立。使用重组质粒pFLAG-CMV-TNF-α和pFLAG-CMV-IL-1β,利用脂质体介导方法对HEK293细胞进行稳定转染,G418做为抗性筛选试剂。建系结果是,获得3株稳定转染入pFLAG-CMV的HEK293细胞,作为阴性对照,分别标号pf1、pf2、pf3;6株稳定转染入pFLAG-CMV-TNF-α的HEK293细胞,分别标号为T1、T2、T3、T4、T5、T6;5株稳定转染入pFLAG-CMV-IL-1β的HEK293细胞,分别标号为I1、I2、I3、I4、I5。4 Western blot检测炎症因子的表达量。首先,蛋白定量,得出标准曲线的公式为y=2203.9x-790.85,其中R2=0.985。Western blot检测结果显示,细胞株T1、T3、T4均能较高表达炎症因子TNF-α;细胞株I2、I3、I5均能较高表达炎症因子IL-1β。结论:1通过高保真酶进行PCR扩增反应,能够准确无误从克隆载体pCMVSport-TNF-α和pCMVSport-IL-1β上扩增得到炎症因子TNF-α和IL-1β的基因序列,并与GeneBank中的序列一致。2重组质粒的成功构建,表现在:一,目的基因准确无误的连入真核表达载体;二,目的基因能够在真核表达载体上得到翻译,即连入基因的“读码框”顺序正确。3稳定表达炎症因子TNF-α和IL-1β的细胞系建系成功。重组质粒DNA整合进HEK293细胞染色体中,目的基因能够在HEK293细胞中有效表达,并会遗传给下一代细胞。