第一部分 研究背景生物发光(bio luminescence)是一种生物体内合成的化学物质不依赖机体对光的吸收,但在特殊酶的作用下将化学能几乎100%转化为光能的发光现象。生物发光现象广泛存在于自然界生物有机体中,比如细菌、昆虫和海洋生物等。其中研究最为广泛的是萤火虫发光体系。生物发光成像(Bioluminescent imaging, BLI)是利用萤光素酶(luciferase)基因标记的细胞产生的萤光素酶与相应底物发生氧化反应,产生可见萤光进行生物体内成像的一项新兴技术。生物发光成像技术具有操作简便、结果直观、高特异性、高灵敏度以及对机体损伤小等优点。该项技术在医学、分子生物学、生物化学和微生物学等多个重要学科中得到广泛应用,在肿瘤生长监测和转移示踪、药物高通量筛选、基因治疗、目标基因表达的检测、干细胞示踪和蛋白-蛋白相互作用等多个领域有着不可替代的技术优势。第二部分 新型萤火虫萤光素酶底物的设计与合成现在应用的萤火虫萤光素酶底物是天然底物D-萤光素和氨基萤光素。萤光素自身的缺点成为生物发光成像技术推广的重要限制因素：第一、生物发光波长短；第二、体内稳定发光时间短；第三、脑部成像灵敏度不足。为解决这些问题主要从两方面入手,一个是萤光素酶的修饰；另外一个是萤光素的修饰。我们采用氨基萤光素作为改造的母核,对6位的氨基进行环烷化,增加衍生物的脂溶性和体内的稳定性,以期得到具有较长生物发光波长和体内半衰期的生物发光底物。我们以4-氟硝基苯和多种环胺为起始原料,经过LiAlH4还原反应、钯碳-氢气还原反应、亲核取代反应、DBU脱硫反应以及氯化钯催化环合反应得到中间体,最后与半胱氨酸盐酸盐—水合物进行环合得到13个新型底物。第三部分 新型萤火虫萤光素酶底物的生物活性评价我们对13个新型萤火虫萤光素酶底物完成生物发光性质测定、酶水平成像活性测定、细胞水平成像活性测试、裸鼠移植瘤模型成像活性测试、转基因鼠模型成像活性测试和裸鼠脑部移植瘤模型成像活性测试等活性研究。生物发光性质测定：利用荧光分光光度计测定新型萤火虫萤光素酶底物的生物发光波长。相较于天然底物D-萤光素和氨基萤光素,新型底物的生物发光波长均有不同程度的增大红移,有助于其在深层组织成像研究的应用。酶水平成像活性测定：利用活体动物成像仪测定新型底物在酶水平生物发光强度的底物浓度依赖性和ATP浓度依赖性。细胞水平成像活性测试：利用活体动物成像仪完成对ES-2-Fluc、4T1-Fluc、 A549-Fluc和U87-Fluc等四种细胞株生物发光强度的底物浓度依赖性和细胞浓度依赖性的测定。我们筛选出三种成像较好的新型底物1.1、1.2和1.3。裸鼠移植瘤模型成像活性测试：构建裸鼠ES-2-Fluc移植瘤模型,腹腔注射新型底物1.1、1.2、1.3和D-萤光素、氨基萤光素,利用活体动物成像仪测定。新型底物1.1、1.2和1.3的生物发光强度明显强于D-萤光素和氨基萤光素。转基因鼠模型成像活性测试：尾静脉注射1mM新型底物1.3、天然底物D-萤光素和氨基萤光素。利用活体动物成像仪测定生物发光强度。裸鼠脑部移植瘤模型成像活性测试：构建裸鼠脑部ES-2-Fluc移植瘤模型,腹腔注射1 mM D-萤光素、氨基萤光素和新型底物1.3,利用活体动物成像仪测定。新型底物13在脑部的生物发光强度明显高于D-萤光素和氨基萤光素。第四部分结论我们为了克服目前天然底物D-萤光素和氨基萤光素生物发光波长较短、体内稳定发光时长不足和低血脑屏障通透性等缺点设计合成了三个系列氮杂环烷氨基萤光素底物。其中新型底物1.1、1.2和1.3在体内成像产生的生物发光强于同等剂量天然底物D-萤光素10倍之多,并且具有长达7小时的体内稳定发光时长,远远超过D-萤光素的10分钟。最值得注意的是,在裸鼠脑部移植瘤模型成像活性研究中新型底物1.3的生物发光强度高出同等剂量天然底物D-萤光素30倍。这些新型萤火虫萤光素酶底物有望成为新的生物发光成像工具,扩展生物发光成像技术的新应用,有助于生物发光成像技术的推广。