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L-丝氨酸(L-Ser)是植物进行蛋白质合成所必需的氨基酸之一,也是植物细胞中多种重要物质合成的前体。因此,L-Ser的缺失能导致植物的生长发育出现异常,例如拟南芥的丝氨酸缺失突变体表现出根部生长受阻,花粉发育异常以及对激素ABA不敏感等。L-Ser可能还具有衰老信号的作用,例如实验室前期工作表明,用外源L-Ser处理紫萍(Spirodela polyrrhiza P143)完整植株或半叶状体,当使其体内浓度达到或超过一定的阈值时即能导致它们的衰老和死亡。为了深入了解植物体内“超量”L-Ser在植物生长发育中的重要作用及其作用机制,本研究以双子叶植物拟南芥(Arabidopsis)和单子叶植物浮萍(Lemna minor)为材料,在发现外源L-Ser处理两种植物能够导致其出现前人尚未报道的生长现象的基础上,首先对“超量”L-Ser抑制拟南芥主根生长发育、促进侧根生长的机制进行了研究,然后对L-Ser在光呼吸途径中的转化酶------丝氨酸：乙醛酸氨基转移酶(SGAT)在拟南芥中的编码基因AtAGTl进行了遗传操作------一方面进行了过表达,另一方面通过RNAi技术进行了敲减表达,以此改变转基因植物的内源L-Ser水平,在验证外源L-Ser的作用的同时,揭示AtAGTl基因可能具有的除光呼吸途径以外的新功能。与此相关,我们还通过在其启动子上连接GUS报告基因,对AtAGTl基因的表达特异性进行了分析。最后,为进一步研究L-Ser在拟南芥根生长发育中调节作用的分子机制,构建了根中L-Ser合成的主要代谢途径的3个酶(3-磷酸丝氨酸磷酸酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶和3-磷酸丝氨酸氨基转移酶)编码基因的过表达载体,目前已经获得了部分遗传转化株系。研究取得的主要结果如下：1.对25天苗龄的拟南芥分别进行1mM L-Ser、1mM L-Trp(对照)和水的喷施实验,每天喷施一次,喷施10天后,喷施1mM L-Ser的拟南芥叶片出现了明显的黄化和局部坏死用,而对照则没有,说明(超过)一定浓度的丝氨酸对拟南芥叶片有促进衰老作用；在培养基中添加不低于1mM的外源L-Ser能够抑制拟南芥主根的生长,促进侧根的生成。随着L-Ser浓度的升高,主根根长受抑制程度也不断增加。2mM L-Ser处理拟南芥7d后,主根根长仅为正常情况下的1/4左右。内源L-Ser含量测定结果表明,培养基中添加外源L-Ser处理引起了内源L-Ser含量的变化,例如在外施浓度为1.5mM时,地下部内源L-Ser含量可增加到对照组的4.5倍左右。利用培养基中添加L-Ser的方法处理拟南芥生长素报告株系DR5:GUS,发现主根和根尖部位生长素的响应至少从处理后的第2天就开始增强,侧根生长素的响应也出现明显的变化,6天以后与未加L-Ser的对照相比,差异已非常明显。基因表达水平检测结果表明,L-Ser导致了生长素输入载体基因AUX1和衰老相关基因SAG12的表达上调,而代谢L-Ser的SGAT编码基因AtAGTl表达的下调。2.用L-Ser处理浮萍愈伤组织,结果发现能提高其再生能力。除L-Ser外,在测试过的所有20种蛋白质合成前体氨基酸中,L-Gly和L-Cys对浮萍的再生也有促进作用,但明显小于L-Sero在植物体内,L-Ser和L-Gly之间可以很容易互相转化,检测发现,当培养基中添加L-Gly后,愈伤组织内源甘氨酸含量在早期出现小幅上调,而丝氨酸的含量却大幅增加,暗示吸收的L-Gly大部分可能转化为了L-Ser,可能由此促进了浮萍愈伤组织的再生。L-Ser是L-Cys合成的前体,因此推测其促进再生的原因可能在于半胱氨酸的吸收导致了内源丝氨酸向半胱氨酸转化的减少,一定程度上引起内源丝氨酸含量的增加。在添加1.0mM L-Ser的再生培养上,再生率在第11天和14天时已分别达到46%和87%,为已报道的浮萍愈伤组织再生的最快速度,这也是最适合浮萍愈伤组织再生的L-Ser浓度,而L-Gly的最适浓度为1.5mM。3.在浮萍中过表达拟南芥的AtAGTl基因,转基因浮萍中SGAT酶活性升高,L-Ser含量降低。虽然在正常生长条件下并未观察到浮萍的表型变化,然而在盐胁迫下,AtAGT1过表达浮萍的抗盐性增强,与野生型相比转基因浮萍根部断裂减少,断根的数目只有对照的约1/3；与此同时光系统II的最大量子产额的下降得到延缓,MDA的含量的增加较少,ROS积累减少,抗氧化系统增强。盐胁迫处理后,AtAGTl过表达转基因浮萍和野生型浮萍SGAT酶活都随着盐浓度的升高(100mM～300mM)先上升后下降,但转基因浮萍SGAT酶活性始终高于野生型；24h盐胁迫处理引起了野生型浮萍L-Ser含量随盐浓度的升高呈线性增长的趋势,转基因浮萍的L-Ser含量则为先上升后下降,并显著低于野生型。AtAGTl过表达引起转基因浮萍抗盐性的增强表明光呼吸途径通过ROS和抗氧化系统参与了抗盐胁迫。4.利用RNAi技术对拟南芥AtAGT1进行的敲减研究结果表明,AtAGT1-RNAi转基因株系中L-Ser含量显著高于野生型,转基因植株矮小,根长变短,叶片出现萎黄斑点。转基因株系的净光合速率下降,叶绿素光谱扫描实验表明其光合色素尤其是叶绿素a和叶绿素b的含量均比野生型明显下降,但出现了一定程度的叶黄素积累。5.为了研究拟南芥AtAGT1基因可能在根中的表达及其生理功能,首先对其启动子进行了生物信息学分析,结果发现AtAGT1启动子具有脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA)和水杨酸(SA)等的响应顺式作用元件和根部特异性元件,暗示AtAGT1基因的表达可能响应多种激素信号并在根部具有表达。因此,我们构建了PAtAGT1:GUS载体,并获得了多株拟南芥遗传转化株系。组织化学染色结果显示,在拟南芥子叶、叶片、下胚轴和根中均能检测到GUS活性,说明AtAGT1基因除了在地上部表达,确实还在根部表达。GUS的活性在幼嫩叶片中要高于衰老叶片中。盐胁迫和干旱胁迫都能增强GUS的活性。此外还发现,激素处理可能对该基因的表达有调控作用,需要进一步深入研究。