药物不良反应(adverse drug reactions, ADRs)是临床上极其常见的疾病之一,占所有住院病因的3%-6%,其临床表现多样,主要侵犯皮肤,对患者的危害程度轻重不一。在ADRs中,药物超敏反应综合征(drug-induced hypersensitivity syndrome, DIHS)是一类具有一定的特征并可危及患者生命的严重皮肤药物不良反应综合症。DIHS又称伴有嗜酸性粒细胞增多及系统症状的药物反应(drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms, DRESS),常表现为在应用致敏药物2-6周或更长时间,患者出现发热、皮疹(以面部及眶周水肿、躯干四肢对称分布的麻疹样皮损或剥脱性皮炎损害为特征)、淋巴结肿大、多脏器受累(肝、肺、肾、心脏)伴血液学异常(嗜酸性粒细胞增多、异常淋巴细胞和/或单核细胞增多)。DIHS常见致敏药物有芳香族类抗惊厥药、别嘌呤醇、米诺环素、磺胺类和抗病毒药物(阿巴卡韦、奈韦拉平)。流行病学调查发现,在应用抗惊厥药苯妥英钠治疗的患者中,DIHS的发病率约为1/10000-1/1000,病死率高达20%-30%。若累及多个器官,则导致患者死亡的风险显著增加。而且该病易复发,在停用致敏药物数周至数月后常可见病情复发。目前,DIHS发病的确切机制仍不完全清楚,深入阐明其发病机制,对提高临床对疾病的认识并针对性开展预防和治疗方法十分重要。研究认为,DIHS发病是一个遗传、药物、病毒和机体免疫反应相互作用的过程,可能涉及致敏药物药代动力学和代谢途径异常、HLA基因遗传易感性以及疱疹病毒的再活化等多个机制。芳香族类抗惊厥药物如卡马西平、苯巴比妥等经肝脏细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP)酶代谢,经芳香族的羟化作用,形成有毒的芳香烃氧化物,再经过环氧化物羟化酶或谷胱苷肽转换酶的作用,生成无毒代谢产物。先天性环氧化物羟化酶(Epoxide hydroxylase)缺陷或者缺乏不具有该代谢功能,导致芳香烃氧化物聚集从而引起细胞毒性反应或异常免疫反应,其有毒中间产物刺激嗜酸性粒细胞、巨噬细胞以及T淋巴细胞异常活化,促使细胞因子特别是白细胞介素-5(IL-5)的分泌,诱导机体超敏反应的发生。目前,用于解释药物超敏反应的假说包括半抗原/前半抗原学说和药理学作用理论(pharmacologic interactions of drug with immunereceptor, P-I concept)。前者认为,药物为小分子,并无免疫原性,但与体内大分子蛋白结合后可成具有免疫原性的半抗原,经抗原提呈细胞(APC)加工处理,并呈递给主要组织相容性复合物(MHC)分子,形成的半抗原-肽-MHC复合物可被T细胞受体(TCR)识别,进而激活T细胞并最终导致药物超敏反应的发生。而P-I理论认为,一些药物可以直接通过APC表面的MHC分子与TCR结合而激活T细胞,特定的药物与TCR有强的关联性。如别嘌醇的代谢产物结合机体自身抗原肽和MHC-I类分子的HLA-B*5801基因结合,提呈给TCR,致CD8效应性T细胞发生细胞毒反应并累及皮肤黏膜,表明DIHS的发病具有遗传基因易感性；此外,DIHS的发生及其病情加重和疱疹病毒序贯再活化也有一定的相关性。最近研究发现,HHV-6的感染和DIHS密切相关。此外,除了HHV-6,在DIHS发病进程中还检测到EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)和巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)的再活化。Picard等利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)法对40例DIHS患者的PBMC和血清进行检测,发现所有患者均能检查到EBV的：DNA, EBV再活化的比例为42%(16/38),HHV-6的再活化比例为45%(17/38),而对照组中并未检测到EBV和HHV的再活化。最新研究认为DIHS是一种对特殊药物的致敏免疫反应。由于致敏药物本身具有活化T细胞的能力,被T细胞摄入后可诱导特异性T细胞增殖,并使病毒基因组整合到T细胞核内,引起针对疱疹病毒的细胞免疫应答,其中CD8+T细胞活化增殖的同时分泌大量细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α,最终导致DIHS伴发的多器官损伤。DIHS发病初期可出现IgG、IgA、IgM和B淋巴细胞计数均降低,并伴随病毒和致敏药物交叉反应的致敏T细胞增殖,即使停用致敏药物,由于病毒抗原的存在,仍造成免疫反应不能终止,因此DIHS患者出现的反复发热、严重的并发症及撤药后病情反复加重与人类疱疹病毒再激活存在着一定的相关性。另有研究认为CD8+T细胞作为主要效应细胞通过分泌穿孔素、颗粒酶以及IL-5和IFN-γ等多种细胞因子参与DIHS的发病过程。根据以上研究表明,CD8+T细胞在DIHS发病过程中发挥了重要作用,而T细胞抗原受体(Tcell antigen receptor, TCR)是其识别特异性抗原及被激活的关键环节。TCR介导的交叉识别(病毒激活的T细胞与某些致敏药物之间存在的交叉反应)是DIHS发病的一个重要原因。近年来关于TCR基因重排的研究已经在病毒感染、移植、肿瘤以及自身免疫疾病方面取得了重大进展。TCR的基因重排是完全随机的,并表现出多家族和多克隆性。互补决定区3(complementarity determining region 3, CDR3)是T细胞直接与抗原接触的位点,一种CDR3氨基酸序列代表一个T细胞克隆,在正常情况下,CDR3谱系多呈现8-10个峰的高斯分布；在病理情况下,某一个或几个亚家族T细胞针对特异抗原产生单克隆或寡克隆扩增,其CDR3谱系表现为单峰或少于8个峰的偏态分布,这种现象被称为TCR谱系漂移。对TCR的CDR3进行谱型分析及序列测定,建立疾病特征性TCRβ CDR3谱系,对了解疾病的严重程度、指导治疗和预防疾病的发生均有重要意义,然而其在DIHS发病过程中的TCR谱系特征及与临床的相关性,目前仍不清楚。根据上述DIHS发病机制,我们选取8例DIHS患者,采集发病的不同阶段外周血,分选PBMC中CD4+和CD8+T细胞,采用高通量测序技术,对DIHS患者T细胞CDR3共同基序或特征性TCR谱鉴定并分析其与DIHS发生、发展及症状严重程度的关系。研究结果：1. CD4+/CD8+ T细胞在DIHS患者外周血中的特征及变化规律1.1.通过主元分析的方法得到,DIHS患者外周血T细胞受体库的TRBV/J基因片段使用呈现高度的个体特异性；与健康人对照相比,没有显著的偏好倾向。这一结果提示我们TRBV/J基因片段的使用频率特征不适宜作为DIHS发病的诊断标志物。1.2.与健康对照外周血相比,DIHS患者外周血中的高频率扩增T细胞克隆的比例表现出明显的升高趋势。并且,扩增T细胞在DIHS患者中的升高趋势对于TCRBNT克隆和CDR3 AA克隆同时成立。这种高频克隆的富集提示DIHS患者发病过程中存在T细胞选择性扩增过程。1.3.在DIHS病程持续过程中,CD4+和CD8+T细胞受体库表现出不同的动态变化规律。我们引入Morisita-Horn相似性系数(MHSI)作为T细胞受体库随时间波动程度强弱的定量指标。通过计算我们发现,患者CD8+T细胞受体库的波动具有两极分布的特征；部分患者其组成保持基本稳定,剩余患者随病症进展其组成具有明显的波动性。并且,通过最大似然聚类方法,我们发现DIHS患者的CD8+T细胞受体库可以将患者显著的区分为“波动组”和“平稳组”患者,而CD4+T细胞则不具有这一特征。1.4.CD8+T细胞受体库的两极变化规律主要反映了DIHS患者维持外周血中高频率T细胞克隆稳定的能力不同。通过聚类分析发现,4例“平稳组”患者在疾病过程中CD8阳性高频克隆基本保持稳定。而4例“波动组”患者的聚类特征显示其病程中外周血CD8高频克隆组成发生了较大变化。该结果与之前MHSI相似性分析结果相一致,并且提示我们高频CD8克隆的波动是造成患者CD8+T细胞受体库组成变化的主要原因。2.CD8+T细胞受体的临床意义及调控机制2.1.CD8+T细胞受体库的波动规律与DIHS患者的临床症状严重程度相关。为了定量研究CD8+T细胞受体库波动的临床意义,我们使用Karnofsky得分和RegiSCAR评分系统对每名患者的临床症状严重程度进行了评价,并且研究其与波动定量参数MHSI的关系。我们发现,患者CD8+T细胞受体库的波动程度与其症状呈正相关；而CD4+T细胞受体库的波动与临床症状相关性很弱。同样的,通过RegiSCAR评分系统,我们进一步确认了这一结果,即,CD8阳性T细胞受体库在病程进展中波动程度大的其临床症状亦较严重。2.2.与“平稳组”患者相比,“波动组”患者的抗HHV病毒家族体液免疫应答更强。具体表现为在DIHS初诊入院时,“波动组”外周血中的抗HHV-6 IgM类抗体滴度升高；以及在完整病程中,“波动组”患者的抗HHV-6 IgG类抗体滴度和抗EBV-EBNA IgG类抗体滴度的同时升高。2.3.患者外周血中CD4阳性抗EBV特异性T细胞克隆的比例与其T细胞受体库的波动程度完全不相关(R=0.06,p=0.8121),提示我们CD4+T细胞抗病毒应答不是其受体库波动的主要原因。另一方面,我们发现患者外周血中CD8阳性抗EBV特异性T细胞克隆的比例与其T细胞受体库的波动程度呈正相关(R=-0.58,p=0.0049),提示我们抗EBV特异性T细胞克隆的扩增是CD8+T细胞受体库波动的驱动因素。2.4.与“平稳组”患者相比, “波动组”患者CD8阳性抗EBV特异性克隆的比例显著升高(p=0.0077)。与之前结果一致的是,我们发现CD4阳性抗EBV特异性克隆的比例在两组患者间没有差别。因此,我们认为持续更新的CD8阳性抗EBV特异性克隆是其受体库波动的驱动因素。主要结论：1.与健康对照外周血相比,DIHS患者外周血中高频率T细胞克隆比例明显升高,呈现选择性扩增的组成特征。2.患者外周血中CD8+T细胞受体库变化程度的不同主要反映了不同患者维持其高频T细胞克隆的能力。3. DIHS患者临床症状严重程度与CD8+T细胞受体库波动强度呈正比,而与CD4+T细胞不具有相关性。4.CD8阳性抗EBV特异性T细胞克隆的比例与其受体库波动程度呈正比,并且在症状严重患者外周血中比例升高,提示抗EBV CD8+ T细胞应答是其受体库波动的驱动因素。