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研究背景脓毒症是威胁人类健康甚至生命的重大疾病,是重症医学研究的重要方向之一。经过数十年的基础研究及临床试验,仍没有根本性的治疗金标准。近些来,他汀类药物以其多向性作用,被广泛的用于脓毒症的治疗研究。有研究指出,他汀类药物可能通过抗炎、保护改善血管功能等对脓毒症产生治疗作用。但在临床及基础研究中,一直对他汀类药物的疗效及临床应用价值存在争议。我们通过细胞及动物学研究,探究辛伐他汀对于脓毒症的保护作用及其机制,为临床运用提供可能依据。目的本研究主要探索辛伐他汀对于脓毒症CLP模型小鼠及A549细胞的保护作用及其可能的分子机制, 并改进药物剂型,通过纳米粒制剂,提高药物的药效,减低毒副作用。方法1)用LPS诱导,造成A549及THP-1脓毒症细胞模型,并通过单独培养及共培养方式,模拟脓毒症时单核细胞释放炎症因子,对于肺泡上皮细胞的作用。使用辛伐他汀纳米粒及普通静脉制剂处理细胞,研究辛伐他汀的抗炎作用及对肺泡上皮可能的保护作用及其机制。2)在对细胞分组处理后,通过划痕实验,检测A549细胞单独培养及THP-1共培养作用下的迁移能力变化。用Western blot检测THP-1及A549中iNOS及eNOS的表达变化。通过ELISA法,检测不同组别THP-1及A549细胞培养基中IL-6、TNF-a炎症因子的含量。3)CLP法建立小鼠脓毒症模型,并以假手术法建立对照组模型。分别以灌胃(口服制剂组)、普通制剂尾静脉注射、纳米粒制剂尾静脉注射,研究辛伐他汀对于脓毒症小鼠的作用,比较不同制剂的药效差异。4)按分组处理小鼠,观察记录小鼠生存率。24小时后,取小鼠腹主动脉及肺,制成石蜡切片。对肺组织石蜡切片行HE染色,观察肺部病理变化。用免疫组化法分别检测肺组织中iNOS、eNOS表达情况,小鼠腹主动脉中iNOS、eNOS、PI3K、AKT、Caveolin的表达情况。探究辛伐他汀对于脓毒症小鼠体内iNOS/eNOS的调节作用及可能机制。结果1)在细胞学研究中,LPS及辛伐他汀各型制剂预处理THP-1细胞24小时后,离心提取细胞培养基,加入培养A549细胞,再培养24小时。直接在A549中加入LPS及辛伐他汀各组制剂,培养24小时。结果提示：LPS组中, A549细胞的迁移较对照组明显增多,辛伐他汀各组较LPS组抑制A549细胞的迁移。与THP-1共培养组迁移距离较单独培养组增加。在THP-1及A549细胞中分别加入LPS与辛伐他汀各组制剂。结果提示：LPS可以促进THP-1分泌IL-6,TNF-a,也能促进A549分泌IL-6,但是在LPS处理组中,同时加入辛伐他汀,IL-6、TNF-a炎性因子的水平明显下降。2)在动物学实验中,我们发现脓毒症小鼠较假手术组死亡率明显增加,辛伐他汀口服组、静脉组、纳米粒组均降低小鼠死亡率,提高生存率。小鼠CLP等处理后24小时,取小鼠肺及腹主动脉。小鼠肺部石蜡切片行HE染色,小鼠肺部病理切片显示,CLP小组较假手术对照组,肺泡破坏、间质中炎性细胞浸润增生明显,辛伐他汀灌胃组和CLP小组结果相近。辛伐他汀普通静脉制剂及纳米粒制剂能明显改善小鼠的肺部病理变化。小鼠肺及腹主动脉石蜡切片,行动物免疫组化染色,结果提示：免疫组化检测提示iNOS在CLP小鼠肺及腹主动脉中,较对照组表达增加,而eNOS较对照组表达受抑制。灌胃组的结果与CLP组相似。在辛伐他汀普通静脉制剂组及辛伐他汀纳米粒制剂组中,eNOS在肺及主动脉中均表达增多。小鼠主动脉免疫组化结果提示,CLP小鼠Caveolin及iNOS表达增加,PI3K、AKT、eNOS在辛伐他汀各组中表达增多。3)在小鼠病理HE染色中提示,辛伐他汀纳米粒组较CLP组明显改善腹部的炎性渗出、肺泡破坏、肺间质增厚等病理变化。并且较辛伐他汀静脉制剂组效果更加明显。在小鼠免疫组化染色中,发现辛伐他汀纳米粒较普通组抑制iNOS表达及促进eNOS表达的效果更加明显。结论1)辛伐他汀能够抑制THP-1细胞中IL-6、TNF-α因子及A549细胞中IL-6炎性因子的释放。2)辛伐他汀能够抑制A549细胞的迁移,从而可能维持了肺泡上皮的正常功能。3)辛伐他汀能够直接降低脓毒症小鼠的死亡率,并且能够明显改善脓毒症小鼠的肺部病变。辛伐他汀对脓毒症小鼠可能具有一定的治疗保护作用。4)我们从细胞学western blot及动物学免疫组化结果得出,辛伐他汀能够直接抑制iNOS的表达,并且通过抑制负性调节蛋白Caveolin蛋白的表达,激活PI3K/AKT通路来促进eNOS的表达,从而保持了小鼠体内iNOS/eNOS的平衡,在脓毒症的病理发展中,起保护作用。5)纳米粒作为新型载药制剂,在我们的实验中,其对改善脓毒症小鼠生存率及肺部病理改变及抑制iNOS表达、促进eNOS表达的效果明显优于其他制剂。