C/EB Pα及其SUMO化修饰在大鼠肺发育过程中的功能作用

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目的  通过检测CCAAT增强子结合蛋白A(CCAAT enhancer binding protein alpha , C/EBPα)、小泛素类蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰C/EBPα、肺表面活性物质和糖原在肺发育过程中的动态表达,探讨 C/EBPα 及其 SUMO化修饰在肺发育中的作用。  方法  根据大鼠肺发育分期,选取孕15.5 d(腺体末期)、17.5 d(小管期)和19.5 d(囊泡早期),生后0.5 d(囊泡中期,肺发育膨胀期)、4 d(囊泡末期,肺发育膨胀期)、7 d(肺泡期,肺泡化阶段)和14 d(肺泡期,平衡生长阶段)肺组织, HE染色观察肺形态结构,免疫印迹(Western-blot)检测C/EBPα蛋白和肺表面活性物质蛋白A(Surfactant Protein A , SP-A)、SP-B、SP-C、SP-D表达,磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)检测试剂盒检测PC分泌情况,过碘酸-雪夫氏染色法(Periodic acid-Schiff,PAS)检测肺组织发育过程当中糖原含量变化情况。免疫荧光双标法(Immunofluorescence double staining,IF)用来检测SUMO-1与C/EBPα蛋白表达的关系。SUMO化修饰C/EBPα蛋白的迁移率通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)方法来测定。  结果  (1)Western-blot方法检测肺表面活性物质蛋白和C/EBPα蛋白表达显示:最早在腺体末期可检测到C/EBPα及SP-A蛋白,SP-B、SP-C和SP-D于小管期开始表达,以后随肺发育均逐渐升高,C/EBPα、SP-A、SP-C生后0.5 d达高峰, SP-D生后4 d达高峰,以后逐渐下降,SP-B生后仍持续升高,C/EBPα及各肺表面活性物质蛋白于生后14 d表达均趋于平稳,C/EBPα表达在胎肺期及出生早期与肺表面活性物质蛋白表达呈正相关(r=0.999、0.991、0.982、0.951,P均<0.05)。  (2)磷脂酰胆碱检测试剂盒检测PC分泌情况显示:腺体末期PC含量少,之后随肺发育,PC分泌逐渐增高,其含量与C/EBPα表达无明显相关性(P均>0.05)。  (3)PAS 检测肺组织糖原含量显示:糖原在腺体末期表达较高,随肺发育糖原含量逐渐下降,小管期及囊泡早期降低幅度尤为显著,肺泡期维持在相对稳定水平,C/EBPα与糖原含量在胎肺期呈显著负相关(r=-1.000,P<0.01)。  (4)免疫荧光双染法检测SUMO化修饰的C/EBPα显示:SUMO-1与C/EBPα在生后14 d肺组织肺泡上皮表达有部分重叠,提示肺中存在SUMO修饰C/EBPα。  (5)温和裂解肺组织,Western-blot 技术检测 SUMO 化修饰 C/EBPα 表达, Co-IP辅助验证其迁移率显示:SUMO化C/EBPα在肺发育过程中呈现动态表达,在腺体末期少量表达,随后表达增加并在孕 17.5 d 表达量达峰值。此后 SUMO化C/EBPα表达量下降,直到肺泡期有稍许回升并最终趋于稳定。在小管期至生后早期,SUMO化修饰C/EBPα表达与糖原含量呈正相关(r =0.947,P<0.05),之后相关不明显(P>0.05)。肺表面活性物质的分泌与SUMO化C/EBPα表达模式大致相反,SUMO化C/EBPα蛋白与SP-A、C、D表达在小管期至肺泡期呈负相关(r=-0.951,-0.979,-0.999,P<0.05),与SP-B表达和PC分泌无明显相关性(P>0.05)。  结论  (1)C/EBPα在肺中呈现动态表达模式,且对AEC II的分化和肺表面活性物质的分泌起到正性作用。  (2)肺组织中存在C/EBPα翻译后SUMO修饰,SUMO化C/EBPα蛋白在肺成熟过程中表达与肺分化和肺表面活性物质表达负相关,提示 SUMO 修饰在肺中对C/EBPα介导的肺细胞分化成熟以及表面活性物质的分泌可能起负性调节作用。
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