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目的:1.探讨六味地黄丸含药血清对过氧化氢（H2O2）所致的氧化应激状态下MC3T3-E1成骨细胞增殖活性、活性氧（ROS）及自噬的影响。2.从ERK/mTOR信号通路角度探讨六味地黄丸含药血清调控自噬对H2O2所致MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的影响。方法:1.体外培养MC3T3-E1成骨细胞,用0.05-0.80 mmol/L的H2O2干预细胞24 h及用5%-30%体积浓度的六味地黄丸含药血清干预细胞24 h,用CCK-8检测细胞增殖情况,并筛选出H2O2及六味地黄丸含药血清最适干预浓度;将MC3T3-E1成骨细胞分为正常组（Blank）、模型组（Model）、经典诱导组（Control）、空白血清组（H+Blank）及六味地黄丸组（H+LWDH）,根据分组采用不同条件培养进行诱导分化干预,共干预14 d后进行ALP染色（钙钴法）。2.将MC3T3-E1成骨细胞分为正常对照组（Control）、模型组（Model）、空白对照组（H+Blank）及六味地黄丸组（H+LWDH）,根据分组干预后,采用荧光探针DCFH-DA检测每组细胞内ROS的含量。3.将MC3T3-E1成骨细胞分为正常对照组（Control）、模型组（Model）、空白对照组（H+Blank）、六味地黄丸组（H+LWDH）及自噬抑制剂组（LWDH+3-MA）,根据分组干预后,采用qRT-PCR检测各组细胞Beclin 1、LC3B mRNA表达。4.将MC3T3-E1成骨细胞分为正常对照组（Control）、模型组（Model）、六味地黄丸组（H+LWDH）、空白对照组（H+Blank）、雷帕霉素组（H+Rap）、U0126组（H+U0126）、雷帕霉素+六味地黄丸组（H+Rap+LWDH）、U0126+六味地黄丸组（H+U0126+LWDH）,根据分组干预后,采用荧光探针DCFH-DA检测每组细胞内ROS的含量、采用qRT-PCR检测各组细胞ERK1/2、mTOR mRNA表达、采用Western blot检测各组细胞LC3、ERK1/2、mTOR、p-ERK1/2、p-mTOR蛋白表达。结果:1.六味地黄丸含药血清对H2O2作用的氧化应激状态下MC3T3-E1细胞增殖活性的影响H2O2的浓度为0.10 mmol/L时,相比于对照组,成骨细胞的平均增殖率为70.65%,其对成骨细胞的抑制作用较为显著（P＜0.05）;当H2O2的浓度再提高时,细胞增殖被进一步抑制,因此选取H2O2浓度为0.10 mmol/L进行后续实验研究。成骨细胞的增殖率与六味地黄丸含药血清浓度正相关,当六味地黄丸含药血清浓度为20%时,成骨细胞的增殖率最高,与空白组对比差异最显著（P＜0.05）;当血清浓度大于20%后,反而对成骨细胞增殖具有抑制作用,说明六味地黄丸含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的增殖。选择血清体积浓度为20%进行后续实验研究。ALP染色结果显示,与Control组相比,Model组细胞膜及胞浆中黑褐色颗粒明显减少,说明H2O2会抑制成骨细胞的ALP活性;与Model组相比,H+LWDH组肉眼及倒置显微镜下皆可见较为明显的黑褐色颗粒,说明六味地黄丸含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的ALP活性。2.六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞内ROS的影响与Control组相比,Model组的ROS荧光强度显著增强（P＜0.05）,说明在H2O2的干预下,成骨细胞处于氧化应激状态;与Model组相比,H+LWDH组荧光强度显著减弱（P＜0.05）,说明六味地黄丸含药血清可以降低细胞的ROS水平,减轻H2O2对成骨细胞造成的氧化损伤。3.六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞自噬相关基因Beclin 1、LC3B mRNA表达的影响与Control组相比,Model组自噬相关Beclin 1、LC3B mRNA表达明显降低（P＜0.05）;与Control组、Model组及H+Blank组相比,H+LWDH组自噬相关Beclin 1、LC3B mRNA表达明显增高（P＜0.05）;与H+LWDH组相比,LWDH+3-MA组自噬相关基因Beclin 1、LC3B mRNA表达明显降低（P＜0.05）。可见在六味地黄丸含药血清保护干预下,成骨细胞Beclin 1、LC3B mRNA的表达增加,说明六味地黄丸含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的自噬水平。4.六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞ERK/mTOR通路的调控作用与Model组相比,Rap组、U0126组、LWDH+Rap组、LWDH+U0126组细胞内ROS水平皆降低（P＜0.05）,说明抑制ERK/mTOR通路可以降低氧化应激状态下成骨细胞的ROS水平,减轻H2O2对成骨细胞的氧化损伤。与Model组相比,H+LWDH组、H+Rap组及H+LWDH+Rap组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ皆上升（P＜0.05）;与Model组相比,H+U0126组、H+LWDH+U0126组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ有上升趋势,但无统计学差异。说明LWDH含药血清及抑制ERK/mTOR通路都可以促进氧化应激状态下成骨细胞的自噬水平,且LWDH含药血清诱导氧化应激状态下成骨细胞的自噬与抑制ERK/mTOR通路相关。与Model组相比,H+LWDH组及Rap组p-mTOR蛋白表达下调（P＜0.05）;与Model组相比,H+Rap+LWDH、H+U0126+LWDH组p-mTOR蛋白有下调趋势,但无统计学差异;与Model组相比,H+LWDH组及H+U0126组p-ERK1/2蛋白表达下调（P＜0.05）;与Model组相比,H+Rap组、H+U0126+LWDH组p-ERK1/2蛋白表达有下调趋势,但无统计学差异。说明六味地黄丸含药血清可以通过抑制ERK/mTOR通路来诱导自噬以减轻成骨细胞的氧化损伤。结论:H2O2能够抑制MC3T3-E1成骨细胞增殖活性,使细胞处于氧化应激状态,并且降低自噬相关Beclin 1、LC3B mRNA表达,提高p-ERK1/2、p-mTOR蛋白的表达;而六味地黄丸含药血清可促进H2O2所致氧化应激状态下成骨细胞增殖活性,降低细胞内ROS水平,提高Beclin 1、LC3B mRNA的表达,降低p-ERK1/2、p-mTOR蛋白的表达。说明六味地黄丸含药血清可通过抑制ERK/mTOR通路诱导细胞自噬来减轻氧化应激状态下MC3T3-E1成骨细胞的损伤,最终达到促进成骨细胞增殖活性的目的。