阳离子化柞蚕丝素包被VEGF165-Ang-1双基因共表达腺病毒的研究

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使支架快速血管化是引导皮肤真皮组织再生的关键问题。血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是两种最重要的仅以血管内皮细胞为靶细胞的促血管再生生长因子,联合使用这两种因子既促进血管的生成,又能使新生血管获得稳定的结构。但生长因子的半衰期短,在体内不稳定。编码VEGF165和Ang-1双基因的腺病毒载体已被证明对血管内皮细胞具有较高的感染效率,并能使其有效表达目的基因,分泌VEGF165和Ang-1因子。将VEGF165和Ang-1双基因腺病毒载体装载到支架内,原位转染细胞,使细胞表达目的基因,合成分泌VEGF165和Ang-1两种生长因子,引导细胞向支架内部迁移,促进血管内皮细胞增殖,可以刺激血管网络的构建,加快真皮再生支架内血管网络的生成速度,从而促进真皮组织的再生。柞蚕丝素蛋白(ASF)具有良好的生物相容性和生物降解性,含有丰富的化学修饰位点。通过化学改性使ASF阳离子化,与带负电荷的腺病毒载体通过静电作用形成丝素/腺病毒复合物,保护腺病毒进入体内免受免疫系统的攻击。复合物作为促血管再生的基因传递载体装载到支架内,移植于其皮肤缺损部位后,预期能在支架内较快地生成血管网络,促进其真皮组织的再生。  本文用精胺对柞蚕丝素蛋白阳离子化改性,使丝素蛋白表面带正电荷,用于对腺病毒(Ad)的物理改性;然后用阳离子化柞蚕丝素蛋白(CASF)与VEGF-Ang-1双基因共表达腺病毒载体复合,使Ad表面由带负电荷转变为带正电荷,作为VEGF165-Ang-1双基因共表达腺病毒的传递载体;探讨有无血清蛋白存在的培养基中,CASF/Ad复合物转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)时,不同浓度比例的CASF对基因转染效果、细胞活性及VEGF165表达分泌水平的影响;并将CASF/Ad复合物装载在丝素支架内,研究CASF/Ad复合物原位转染HUVEC的转染效率及对细胞增殖的影响。  首先,精胺在碳化二亚胺的介导下,对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性。改性后的柞蚕丝素蛋白的 Zeta电位由负值翻转为正值,并且随着精胺占柞蚕丝素的质量比的增加,Zeta电位增大。傅立叶变换红外吸收光谱等手段进行的分析结果表明,柞蚕丝素蛋白侧链上的羧基与精胺上的氨基发生反应,生成了新的酰胺键。  其次,用不同浓度比例的CASF包被腺病毒Ad载体,通过静电相互作用制备CASF/Ad复合物。复合物体外转染HUVEC的实验结果表明,与裸Ad相比,CASF/Ad复合物对细胞的毒性小,细胞活性普遍可达到101.99%以上,最高可达到107.85%;并且能够提高转染效率,当CASF浓度为10、20、50、100μg/mL时,CASF/Ad复合物对细胞的转染效率均能够达到95%以上。即使在胎牛血清蛋白存在的条件下,相比于裸的腺病毒,CASF能够保护复合物保持较高的转染效率。ELISA检测结果表明,裸的腺病毒或者CASF/Ad复合物感染HUVEC能够显著地促进VEGF165的分泌,CASF浓度为50和100μg/mL的CASF/Ad复合物通过提高对内皮细胞的转染效率,能使细胞在第五天达到VEGF165分泌的最高水平。  最后,通过冷冻干燥法将CASF/Ad复合物装载到丝素多孔支架内,得到具有基因活性的多孔支架,并探讨了CASF/Ad复合物中的CASF浓度对接种于支架内的HUVEC增殖和基因表达水平的影响。结果表明,相比于空白支架,细胞在装载CASF/Ad复合物(200μg/mL)的支架内能够获得较高的转染效率且增殖速度显著加快。  上述结果表明,阳离子化柞蚕丝素蛋白包被VEGF65-Ang-1腺病毒载体后,可保护病毒载体,提高目的基因的转染效率。将CASF/Ad复合物装载到丝素多孔支架内后,能够原位转染周围细胞,表达分泌VEGF和Ang-1因子。该丝素多孔支架若用作真皮的引导再生模板,将能够刺激血管内皮细胞在支架内部迁移、增殖,促进血管网络的构建,从而具备促进真皮组织再生的潜力。
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