油棕中果皮MADS-box转录因子EgAGL9的克隆及功能验证

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油棕(Elaeis guineensis Jacq.)是目前世界上最重要的的油料作物之一,同时也是产油效率最高的油料作物,被誉为“世界油王”。油棕原产于非洲热带地区,目前在中国台湾、海南等热带地区均有分布。MADS-box转录因子作为一个古老且庞大的基因家族,在高等植物生长发育的每一个阶段中都发挥重要作用。本研究基于之前已有的油棕果实后三个不同发育阶段的差异表达基因数据,挑选了一个AGAMOUS类的MADS-box转录因子,将其命名为EgAGL9,属于II型MADS-box基因家族。本研究以EgAGL9为研究对象,通过生物信息学分析、染色质免疫与二代测序相结合技术(Chromatin Immunoprecipitation-Sequence,ChIP-seq)、构建植物表达载体、油棕胚状体的遗传转化、油脂分析等方法阐明了EgAGL9调控下游基因的分子作用机制,取得的主要研究结果如下:1.从油棕果实中果皮RNA中成功克隆到EgAGL9基因,729bp,生物信息学分析结果显示EgAGL9的MADS-box结构域高度保守,可能与其它AGAMOUS类MADS-box家族基因行使类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,EgAGL9在油棕果实发育后期表达量持续上升。构建含有35s特异性启动子的植物表达载体p35MK1-EgAGL9,发现其定位在细胞核中。构建p GBKT7-EgAGL9酵母表达载体,发现EgAGL9具有转录激活活性,具备转录因子的特性。2.通过ChIP-seq技术手段成功筛选到三个被EgAGL9调控的下游基因EgSAD、EgTSA、EgSDH。EMSA结果表明:EgAGL9可以分别与EgSAD、EgTSA、EgSDH启动子区域的motif结合。3.构建p CAMBIA1300s-35s-EgAGL9植物表达载体,由根癌农杆菌介导转入油棕胚状体中,通过后续筛选鉴定,得到了EgAGL9相对表达量超过野生型30000倍的阳性转基因胚状体株系。油棕胚状体稳定过表达和瞬时转染油棕原生质体的荧光定量结果表明:EgAGL9的表达量显著性升高时,EgSAD的表达水平显著性降低,EgTSA的表达水平显著性降低,EgSDH的表达水平显著性降低。4.提取转基因EgAGL9胚状体总油脂,甲酯化后进行GC-MS分析,结果表明:野生型胚状体中总脂肪含量约为转EgAGL9的阳性胚状体中总脂肪含量的2.53倍;不同种类脂肪酸相对含量也产生了变化,与野生型相比,转基因胚状体株系中硬脂酸(C18:0)、C20:1、C20:2的相对含量极显著性增加,而油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)的含量极显著性降低。综上所述,EgAGL9与EgSAD、EgTSA、EgSDH这三个基因的启动子区域存在互作,通过稳定过表达EgAGL9胚状体、原生质体转化、荧光定量等实验均可证明EgAGL9直接调控EgSAD、EgTSA、EgSDH的表达。本实验结果初步阐明了EgAGL9通过抑制EgSAD的表达调控油酸(C18:1)的相对含量进而影响油棕不饱和脂肪酸代谢,通过抑制EgTSA的表达影响吲哚的含量进而调控激素代谢,通过抑制EgSDH的表达调控TCA循环从而使得总油脂的含量减少,为之后续代谢通路及调控机制的阐明提供一定的研究基础。
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