牡蛎锌离子结合活性肽的分离纯化及其促锌吸收效果研究

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锌作为重要的矿质元素之一对于维持人体的新陈代谢必不可少,但缺锌症状较为常见。目前市场上存在许多补锌产品,其安全性和生物利用率并不高。许多研究证明了肽具有促进矿质元素吸收的能力,作为新型的矿质离子补充剂,肽-锌复合物的构效关系及其作用机理尚不明确,限制了对其进行研究与开发利用。因此,本研究以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)为原料,采用生物酶解技术制备锌离子结合活性肽,并对其进行分离纯化,解析其结构特征,并通过动物实验,探讨肽-锌复合物的补锌效果,阐述其生物利用的可能机理。研究内容主要包括:  1.牡蛎锌离子结合活性肽的酶解与反应条件优化。以锌离子结合能力和蛋白回收率为指标,对六种商业蛋白酶及其复合酶酶解方式进行筛选优化,确定胃蛋白酶为最佳水解酶;在此基础上对胃蛋白酶酶解过程中的水解度和锌离子结合能力进行研究,发现当水解时间为150 min时,水解度和锌离子结合能力均达到最大值,分别为24.44%和5.36μg/mg;采用单因素实验的方法,对牡蛎酶解物与锌盐反应过程中的pH,多肽蛋白(配体)浓度,蛋白与锌盐的质量比,反应的温度和反应时间进行分析,得出多肽与锌盐反应的最适条件为:pH6.5,肽浓度4%,肽与锌盐的质量比3:1,反应温度40℃,反应时间30min;通过测定胃蛋白酶酶解液中不同组分含量和锌离子结合活性证实了<5kDa组分占优势,其含量为88.11%,锌离子结合能力为5.21-5.30μg/mg。  2.牡蛎锌离子结合活性肽的分离纯化与结构解析。通过固定化金属亲和层析(IMAC-Zn2+)筛选出酶解物中锌离子结合能力强的组分F3,后用反相高效液相色谱(RP-HPLC)将该组分作进一步分离并用液质联用(LC-MS/MS)鉴定出目的组分(F32)序列为HLRQEEKEEVTVGSLK(从N端到C端),分子量为1882.0Da,经测定F32的锌离子结合能力为6.56μg/mg,显著高于粗酶解液(P<0.05);体外模拟胃肠道消化实验显示该序列的活性能够绝大部分的保留,约为原始的85.98%;紫外和红外光谱中发现了锌离子结合前后肽谱图中出现了特征吸收峰的消失、减弱和迁移,这些均证实了多肽中的氨基氮原子和羧基中的氧原子是锌离子结合的主要位点。  3.牡蛎锌离子结合活性肽的补锌效果研究。对缺锌大鼠补充不同形式的锌盐,观察其生长状况,发现缺锌组大鼠4周的体重增重率仅为17.3%,远远低于补锌组,而牡蛎肽-锌复合物和CPP-锌复合物组的效果优于无机锌组,说明缺锌会影响大鼠的生长;不同组织和器官中的锌含量同样显示牡蛎肽-锌复合物组和CPP-锌复合物组结果相似,且高于无机锌组和缺锌组;表观吸收率的实验结果中无机锌组为78.62%,而牡蛎肽-锌复合物和CPP-锌复合物组分别为84.02%和85.40%,明显高于前者(P<0.05),表明牡蛎肽具有较好促进锌吸收的效果,但其转运机制、生物利用途径及详细的吸收机理还需要进一步探讨。
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