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目的:COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)和二甲双胍是临床常用药物,近年来发现两种药物都具有抗肿瘤效应,但临床研究表明单独使用其中一种药物不能有效降低肝癌术后复发率。本研究旨在观察两种药物联合应用能否抑制DEN诱导的大鼠肝癌发生,同时检测p-mTOR、p-AMPK在大鼠及人肝癌组织中的表达,通过p-mTOR、p-AMPK在肝癌组织中的变化探讨二甲双胍联合塞来昔布在肝癌的可能的抗肿瘤机制。方法:1.体外培养人肝癌细胞株HepG2和HCCLM3,96孔板中每孔种20000个细胞,分3组:塞来昔布50mM;二甲双胍500 uM;塞来昔布50mM+二甲双胍0.5 mM,三组肝癌细胞加药处理48小时,利用MTT法检测各组药物对细胞活性的影响2.选用近交系的SD雄性大鼠98只,随机选择10只作为正常组,实验过程中不予特殊处理。余下88只随机分为4组,每组22只:二甲双胍组,塞来昔布组,联合用药组,对照组。每只大鼠均腹腔注射DEN(50mg/kg,1次/周),共18次。二甲双胍组按二甲双胍300mg/(kg.d)灌胃给药,塞来昔布组按塞来昔布100mg/(kg.d)灌胃给药,联合用药组按二甲双胍300mg/(kg.d)+塞来昔布100mg/(kg.d)灌胃给药,对照组用生理盐水3ml/d灌胃给药,喂药周期为18周。喂养过程中,观察记录大鼠的一般情况和体重。18周后处死大鼠,切除大鼠肝癌组织、癌旁组织和可疑癌结节,用中性福尔马林固定24h后包埋做成蜡块,并进行苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察大鼠成瘤情况和肝硬化情况,同时,将蜡块切片进行免疫组织化学染色,检测p-mTOR、p-AMPK的表达情况。3.收集2013年在广西医科大学附属肿瘤医院接受手术切除的肝癌患者的石蜡标本,采用免疫组织化学染色方法检测p-AMPK和p-mTOR蛋白在35例肝癌组织及7例癌旁组织的表达情况。结果:1.在体外细胞实验中,联合用药组HepG2和HCCLM3细胞增殖活性较单独用药组明显降低。2.大鼠成瘤实验结果:18周后处死所有大鼠,共计77只,其中DEN组19只,塞来昔布组18只,二甲双胍组14只,联合用药组16只,正常组10只。解剖后发现,正常组大鼠肝脏组织呈鲜红色,质地柔软,表面光滑,无异常;实验组大鼠可见部分肝脏质地变硬,缩小,表面凹凸不平,色泽暗红无光泽,可见大的单发肿物或多发肿物和一些颗粒状硬化结节。结合大体解剖结果和HE染色结果,大鼠的最终成瘤率为:对照组(DEN组)成瘤率为63.2%,二甲双胍组为42.9%,塞来昔布组为38.9%,联合用药组为18.8%,联合组成瘤率最低,各亚组之间比较差异有统计学意义(p<0.05)。3.联合用药对DEN诱发肝癌大鼠p-mTOR、p-AMPK的影响:免疫组化结果显示:DEN组、塞来昔布组、二甲双胍组、联合用药组四组大鼠p-mTOR的阳性表达率分别为61.10%、53.2%、41.7%、35.7%,p-AMPK的阳性表达率分别为33.3%、53.3%、66.70%、71.4%。可见联合组大鼠肝脏组织p-mTOR的阳性表达率最低,而p-AMPK的阳性表达率最高。4.病人癌组织及癌旁组织的免疫组化结果显示:p-mTOR蛋白在肝癌中的表达阳性率高于癌旁组,且低分化肝癌的表达阳性率要高于高、中分化肝癌;p-AMPK蛋白在肝癌组织中的表达阳性率低于癌旁组织,且高、中分化肝癌的表达阳性率高于低分化肝癌结论:1.COX-2抑制剂塞来昔布联合二甲双胍能够抑制肝癌细胞增殖2.COX-2抑制剂塞来昔布联合二甲双胍能够抑制DEN诱导的大鼠肝癌的发生,其机制可能与激活AMPK蛋白,抑制mTOR蛋白相关。